Regulation of Renal Ion Channels by Serum and Glucocorticoid Inducible Kinase Isoforms, Ubiquitin Ligase Nedd4-2 and NHE3 Regulating Factor 2 in the Xenopus Laevis Oocyte Expression System
Die Serum und Glucocorticoid-abhängige Protein-Kinase (SGK) ist eine Serin/Threonin-Proteinkinase, die über eine Signalkaskade via Phosphatidylinositide 3-Kinase (PI3-kinase) und 3-Phosphoinositid-abhängige Proteinkinase 1 (PDK1) phosphoryliert und damit aktiviert wird. Auf gleichem Wege werden die später entdeckten Isoformen der SGK, die SGK2 und SGK3 aktiviert. Über den genannten Signalweg stimuliert insulin-like growth factor 1 (IGF-1) die drei Kinasen. Darüberhinaus werden sie durch oxidativen Stress aktiviert. Die Transkription der SGK1, nicht aber der SGK2 und SGK3, wird durch Serum, Glucocorticoide, Aldosteron, hohe extrazelluläre Osmolarität und transforming growth factor beta (TGF-&
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Die mutmaßliche Rolle der SGK1 und seiner Isoformen SGK2 und SGK3 in der Regulation renaler Ionenkanäle, die für Kalium-, Kalzium- und Chloridtransport verantwortlich sind, ist untersucht worden. In der Niere ist das SGK1 Expressionsniveau in Epithelzellen des distalen Tubulus und des Sammelrohrs sehr hoch. Bei hohen Glukosekonzentrationen werden SGK1 Transkripte auch im aufsteigenden Ast der Henle-Schleife nachgewiesen.
NHERF2 und SGK1 interagieren miteinander und steigern damit die ROMK1 Aktivität, indem sie vor allem die Anzahl der Ionenkanäle in der Zellmembran erhöhen. Dabei interagiert SGK1 mit NHERF2 über dessen zweite PDZ Domäne. Eine Deletion der zweiten PDZ Domäne oder der vermeintlichen PDZ Bindungsstelle im ROMK1 Protein verhindert die Kanalstimulation. Diese Interaktion erlaubt die Integration genomischer Regulation und Aktivierung durch SGK1 und NHERF bei der Kontrolle der ROMK1 Aktivität und der renalen Kaliumausscheidung.
Ferner wurde die Wirkung von Serum und Glucocorticoid induzierten Kinase (SGK) Isoformen und NHE3 Regulating Factor 2 (NHERF2) auf den epithelialen Kalcium Kanal (ECaC1) untersucht. Während SGK1 und SGK3 und NHERF2 eine ECaC1 Stimulierung, die durch den Ca2+-abhängingen Chloridstrom sowie die radioaktiv markiertes Ca2+ Aufnahme bestimmt wird, zeigen, haben SGK2 und Protein kinase B (PKB) unabhängig von NHERF2 keinen solchen Effekt. Die konstitutiv aktive Form S422DSGK1 und die inaktive K127NSGK1 wurden hergestellt. S422DSGK1 aber nicht K127NSGK1 zusammen mit NHERF2 verfügt immer noch über die Stimulationswirkung auf ECaC1. Der Kinase-hemmer Chelerythrin (10 µM) inhibiert die Aktivität von ECaC1.
Pull-down Assays zeigen die Interaktion vom Carboxy-Ende des ECaC1 mit NHERF2, während funktionelle Experimente die Herabsetzung der Stimulationswirkung von SGK1 und einer NHERF2 mit deletierter zweiter PDZ Domäne zeigen. Die Schlussfolgerung ist, dass SGK1 ECaC1 durch Interaktion mit dem zweiten PDZ Domain von NHERF2 stimuliert. NHERF2 bindet an das Carboxy-Ende Tail von ECaC1, welches ECaC1 dadurch mit dem Aktin Zytoskellet stabilisiert.
Letztendlich wurde zudem der Effekt der SGK Isoformen und der Ubiquitin Ligase Nedd4-2 auf den renalen, epithelialen Chloridkanal (ClC-Ka/barttin) untersucht. Expression von ClC-Ka/barttin verursacht einen schwach einwärts gleichrichtenden Strom, der signifikant durch die Koexpression von Nedd4-2 herabgesetzt wird. Die Koexpression von S422DSGK1, SGK1 oder SGK3, aber nicht die Koexpression von SGK2 oder K127NSGK1, stimulierte den Strom signifikant beziehungsweise hob teilweise den Effekt von Nedd4-2 auf. Die Herrunterregulation von ClC-Ka/Y98Abarttin wird durch die Elimination des PY Motifs im ClC-Ka/Y98Abarttin aufgehoben. Die vorliegenden Beobachtungen legen einen neuen Regulationsmechanismus für ClC-Ka offen, der höchstwahrscheinlich in der Transportregulation in der Niere und im Innenohr beteiligt ist.
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