Entwicklung und Anwendung eines Enzymimmuntests zum Nachweis des Mykotoxins Tenuazonsäure in Lebensmitteln
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Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Anwendung eines enzymimmunologischen Verfahrens zum quantitativen Nachweis von Tenuazonsäure (TeA), einem Mykotoxin der Alternaria-Gruppe, in Apfel- und Tomatenprodukten.Zur Herstellung eines immunogenen Toxin-Protein-Konjugates und eines enzymmarkierten Antigens wurde TeA zunächst mittels Bernsteinsäureanhydrid derivatisiert. Für die Kopplung dieses Toxinderivates an Trägerprotein (Hämocyanin, KLH) zur Immunogensynthese sowie an das Enzym Meerettichperoxidase (HRP) zur Herstellung eines markierten Antigens wurde eine aktive Estermethode verwendet. Nach Immunisierung von Kaninchen mit TeA-KLH konnten Antikörper gegen TeA gewonnen werden. Die Immunantwort wurde mittels eines kompetitiven direkten Enzymimmuntest (Doppelantikörpertechnik unter Verwendung von Anti-Kaninchen-IgG) untersucht. Die Spezifität wurde durch Vergleich von TeA-Standardlösung mit anderen relevanten Substanzen getestet. Das TeA-KLH-Konjugat induzierte eine TeA-spezifische Immunantwort. Vier Wochen nach Grundimmunisierung konnten bei drei von vier Tieren Antikörpertiter nachgewiesen werden. Das Antiserum eines Tieres (K1) erwies sich nach der Restimulation als ausreichend empfindlich. Ein kompetitiver direkter Enzymimmuntest (TeA-Enzymimmuntest) wurde entwickelt unter Verwendung von Anti-TeA-Antiserum und TeA-HRP-Konjugat. Der TeA-Enzymimmuntest war mäßig empfindlich für freie TeA (50%-Inhibitionsdosis: 223 ng/ml), aber sehr empfindlich für acetylierte TeA (50%-Inhibitionsdosis 23,3 ng/ml; Nachweisgrenze (70%-Inhibitionsdosis): 5 ng/ml). Die Spezifität dieses direkten, simultanen Nachweisverfahrens für Tenuazonsäure wurde durch Einsatz anderer Toxine aus der Alternaria-Gruppe überprüft. Kreuzreaktionen mit anderen Alternaria-Toxinen (AOH, AME und ALT) lagen bei <1%. Dieses Ergebnis war nicht überraschend, da die chemische Struktur von TeA keinerlei Ähnlichkeit mit der der anderen Toxine der Alternaria-Gruppe aufweist. Aufgrund der circa zehnfach höheren Empfindlichkeit des Testsystems für TeA-Acetat als für freie TeA wurde ein Protokoll für die Probenaufbereitung erstellt, das die Acetylierung von eventuell in der Probe vorhandenem TeA-Toxin einschloss. Für die Überprüfung der Anwendbarkeit dieses Tests wurden Apfel- und Tomatenproben verwendet. Zum Nachweis von TeA in Apfel- und Tomatenproben erfolgte eine Extraktion nach Aufreinigung mittels Flüssig-Flüssigverteilungschromatographie mit Ethylacetat entweder bei der unverdünnten Probe (Apfelsaft, Tomatensaft) oder bei der mit A. dest. verdünnten Probe (Tomatenketchup, Tomatenmark). Nach Verdampfen erfolgte die einstündige Acetylierung der Probe mit anschließender Verdünnung mit PBS 1:20. Weitere Verdünnungen wurden mit 5% Acetonitril/PBS angefertigt. Die Nachweisgrenzen für TeA in unterschiedlichen Probenmatrices lagen zumeist bei 25-50 ng/g, für Tomatenmark bei ~ 150 ng/g. Die Wiederfindungsraten in unterschiedlichen Probenmatrices waren zumeist zufriedenstellend (34-136%). Eine Probe von sieben untersuchten Apfelsäften enthielt TeA in einer Konzentration von 58 ng/ml. Drei von fünfzehn untersuchten Tomatensäften enthielten TeA in einem Konzentrationsbereich von 61-227 ng/ml, und zwei von achtzehn untersuchten Tomatenketchupproben enthielten TeA in Konzentrationen von 55,2 ng/g und 67,3 ng/g. In keiner der zehn untersuchten Tomatenmarkproben konnte TeA nachgewiesen werden.In einer Untersuchung zum Vorkommen von TeA in natürlich mit Schwärzepilzen kontaminierten Tomaten aus dem deutschen Einzelhandel konnte gezeigt werden, dass nach längerer Lagerung hohe Gehalte (max. 480 ng/g) an TeA im Fruchtfleisch erreicht wurden. Mikroskopisch wurden in einigen dieser Proben Alternaria spp. festgestellt, im Enzymimmuntest konnte in diesen Proben TeA nachgewiesen werden. Bei einer Untersuchung des Vorkommens von Tenuazonsäure bei verschiedenen Pilzspezies wurden unterschiedliche Schimmelpilze (Penicillium sp., Aspergillus spp., Alternaria sp.) aus der Stammsammlung des Instituts geprüft. Lediglich im Mycel von Alternaria spp. wurde TeA nachgewiesen, hier allerdings in extrem hohen Konzentrationen (130.000 ng/g).Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
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Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler