Gammaherpesviren bei kleinen Wiederkäuern, Zoo- und Wildtieren

Abstract

Bösartiges Katarrhalfieber (BKF) ist eine meist tödlich verlaufende, meldepflichtige Erkrankung von Paarhufern, die durch verschiedene Macaviren der Unterfamilie Gammaherpesvirinae aus der Familie Herpesviridae ausgelöst wird. In der Regel handelt es sich dabei um eine Einzeltiererkrankung. Seit den ersten Fällen von Blauzungenkrankheit in Deutschland hat der Nachweis von Macaviren im Rahmen der Differenzialdiagnostik an Bedeutung gewonnen. Ungezielte Methoden zur Virusdiagnostik wie die Virusanzucht in Zellkultur und die Elektronenmikroskopie sind im Hinblick auf Macaviren nicht erfolgversprechend. Für eine Labordiagnose ist die PCR Mittel der Wahl. Bisher wird hierfür von den meisten Labors eine OvHV-2-spezifische PCR bei Rinderproben eingesetzt. Ein Ziel dieser Arbeit war es, die diagnostischen Möglichkeiten so zu erweitern, dass ein möglichst breites Spektrum von potentiellen BKF-Erregern detektiert werden kann. Weiterhin sollte ein System zur Vermehrung von CpHV-2 gefunden werden. Bezüglich der BKF-Diagnostik wurden zwei neue konventionelle PCR-Verfahren mit breitem Nachweisspektrum für Macaviren und eine OvHV-2-CpHV-2-diskriminierende Echtzeit PCR etabliert. Weiterhin wurden zwei serologische Verfahren, ELISA und Serumneutralisationstest, miteinander verglichen. Dafür wurden Proben von 276 Wildwiederkäuern, 230 Ziegen und 58 Schafen untersucht. Bei der Antikörperbestimmung ist der kompetitive ELISA dem SNT im Hinblick auf Arbeitszeit, Aufwand und Qualität der Testergebnisse deutlich überlegen. Für den Einsatz in der Routinediagnostik wird der ELISA vor allem für Hauptwirte empfohlen. Der Bedarf breit angelegter Detektionsmethoden für die BKF-Diagnostik konnte im PCR-Bereich anhand von 18 positiven Resultaten bei Wildtierproben demonstriert werden. Diese 18 Proben führten zu negativen Ergebnissen beim Einsatz der OvHV-2-spezifischen PCR, aber zu positiven Ergebnissen mit den PAN-Macavirus-PCR-Verfahren. Klonierung, Sequenzierung und eine phylogenetische Analyse der Amplifikate führten zu den Nachweisen von CpHV-2, CpHV-2-ähnlichem und BoHV-6-ähnlichem Macavirus.Erstmals konnte CpHV-2-induziertes BKF bei zwei Banteng-Rindern (Bos javanicus) festgestellt werden. Bisher wurde CpHV-2 nur als Auslöser der Erkrankung bei Hirschen und Elchen angesehen. Die Daten zeigen, dass die bisher ausschließlich durchgeführte OvHV-2-Diagnostik im Rinderbereich zu falsch negativen Befunden führen kann. Die beschriebene Etablierung einer OvHV-2-CpHV-2-diskriminierenden Echtzeit PCR ermöglicht eine schnelle Unterscheidung zwischen den beiden in Europa vorkommenden Hauptverursachern von BKF. Diese Methode ist für den Einsatz in der Routinediagnostik für kleine Wiederkäuer und Rinder gut geeignet. Für den Einsatz bei Wildtieren sind die breiter angelegten konventionellen PCR-Methoden vorzuziehen.Anzuchtversuche ausgehend von CpHV-2-positiven ZNS-Proben von Hirschen wurden auf unterschiedlichen Zelllinien durchgeführt. Weiterhin konnten Primär- und Sekundärkulturen aus Ziegen-Lymphozyten etabliert werden. Abschließend wurde ein vergleichbarer Virusanzuchtversuch auf diesen Sekundärkulturen durchgeführt. Bei allen Ansätzen kam es jedoch zum Verlust der virusspezifischen DNS. Zusätzlich wurde ein Transfektionsversuch mit Nukleinsäure aus dem oben angeführten ZNS von erkrankten Hirschen auf PT-Zellen durchgeführt und Überstände sowie Zellen mittels Echtzeit PCR untersucht. Auch dieser Ansatz erlaubte nicht die Kultivierung von CpHV-2. Malignant catarrhal fever (MCF) is a fatal, notifiable disease of Artiodactyla, which is caused by different Macaviruses of the subfamily Gammaherpesvirinae of the family Herpesviridae. MCF usually occurs only sporadically. Within the framework of differential diagnostics the detection of Macaviruses has become more important since the first cases of bluetongue disease were noticed in Germany. Undirected virological methods like virus propagation in cell culture and electron microscopy are not promising with regard to Macaviruses. PCR is the method of choice for laboratory diagnosis. Until now most laboratories use the OvHV-2 specific PCR for samples of cattle. One objective of this work was to improve the diagnostic tools for the detection of a broad spectrum of potential MCF-viruses. Furthermore experiments towards the establishment of a system for the cultivation of CpHV-2 were performed.With regard to MCF-diagnostics two new conventional PCR-methods and an OvHV-2-CpHV-2-discriminating realtime PCR were established, which allowed to detect a broad spectrum of macaviruses. Furthermore two antibody-test-systems, ELISA and serum neutralisation assay (SNA), were compared to each other. Samples of 276 wild ruminants, 230 goats and 58 sheep were examined by these methods.Concerning time, effort and quality of result the competitive ELISA was clearly superior to SNA. ELISA is recommended for routine diagnostic use, especially for reservoir hosts. The importance of broadly reactive PCR detection methods could be demonstrated by 18 positive results of wild animal samples. All 18 cases led to negative results with OvHV-2-specific PCR, but reacted positive in the PAN-Macavirus-PCR. Cloning, sequencing and phylogenetic analyses of the amplificates led to the detection of CpHV-2, CpHV-2-resembling and BoHV-6-resembling Macaviruses.For the first time CpHV-2-induced MCF was detected in two Banteng-cattle (Bos javanicus). Until now, CpHV-2 has been considered as a cause of MCF only in deer and moose. This implies that routine OvHV-2-specific-diagnostic in cattle is insufficient. The establishment of an OvHV-2-CpHV-2-discriminating realtime PCR allowed rapid differentiation between the two most common causative agents of MCF in Europe. This method is suitable for application in routine diagnostics of small ruminants and cattle. For the application in wild ruminants the broadly reactive conventional PCR is more suited.Using CpHV-2-positive CNS-samples of MCF-diseased deer as starting material, it was attempted to cultivate the virus in different cell lines. Furthermore, primary and secondary cultures of goat lymphocytes were established and used for propagation trials. However, after prolonged incubation Macavirus specific DNA could not be detected.Finally PT-cells were transfected with nucleic acid prepared from the above mentioned CpHV-2 positive deer-CNS and supernatant as well as cells were tested by realtime PCR. This approach did also not lead to detectable replication of CpHV-2.