Die Rolle von TRPC-Kanälen in der chronisch Hypoxie-induzierten pulmonalen Hypertonie in der Maus

Abstract

Pulmonale Hypertonie (PH) ist ein Sammelbegriff für schwere Erkrankungen, welche durch einen pulmonalen Gefäßumbau und der damit verbundenen Erhöhung des Gefäßwiderstands sowie des pulmonalarteriellen Druck charakterisiert sind. Im Pathomechanismus der PH wird der Gefäßumbau unter anderem durch die erhöhte Proliferation und Migration sowie die verminderte Apoptose von pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen (PASMC) verursacht. Die intrazelluläre Ca2+-Konzentration spielt in der Proliferation und der Migration der PASMC eine essentielle Rolle, die Bedeutung von Ca2+-Kanälen an der PH sind bisher aber nur in Ansätzen untersucht worden. Insbesondere die nicht-selektiven Kationenkanäle der klassischen transient receptor potential (TRPC) -Subfamilie gelten hier als aussichtsreiche Kandidaten. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es die TRPC-Proteinen im Pathomechanismus der chronisch Hypoxie-induzierten PH (CHPH) zu identifizieren und zu charakterisieren. Es zeigte sich, dass die mRNA-Expression von TRPC1 in PASMC aus der Maus, der Ratte und des Menschen durch chronische Hypoxie induziert wurde. Die mRNA-Expression von TRPC3 und TRPC4 war in murinen PASMC vermindert, während TRPC5, TRPC6 und TRPC7 nicht reguliert waren. Unter Verwendung von TRPC1 knockout Mäusen im Modell der CHPH wurde gezeigt, dass der Verlust von TRPC1 zu einem verminderten pulmonalen Gefäßumbau führte und in einem reduzierten rechtsventrikulären systolischen Druck resultierte, wodurch TRPC1 knockout Mäuse partiell vor der Entstehung der CHPH geschützt sind. Im Modelsystem der isolierten, ventilierten und blutfrei-perfundierten Mauslunge, während akuter und anhaltender Hypoxie, zeige sich hingegen, dass TRPC1 keine Relevanz an der hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion hat. Auf Zellebene wurde der Einfluss von TRPC1 auf die Proliferation, die Migration und die Apoptose der murinen PASMC charakterisiert. Der knockout sowie der knockdown von TRPC1 führte zu einer verminderten Proliferation unter chronischer Hypoxie. Des Weiteren führte der knockout von TRPC1 zu einer vollständigen Inhibition der chronisch Hypoxie-induzierten Migration. Bei der Untersuchung des downstream-Signalwegs wurde ein Anstieg in der Expression der Proliferations-assoziierten Proteine Ki67 und Cyclin D1 unter chronischer Hypoxie beobachtet. Außerdem wurde eine verminderte Expression von glattmuskulärem alpha-Aktin (alpha-SMA) festgestellt, welches mit einem Wechsel vom kontraktilen zum proliferativen Phänotyp assoziiert ist. Chronische Hypoxie führte zudem zur Phosphorylierung von p38, nicht jedoch von extrazelluläre signalregulierte Kinsase 1 und 2 (Erk1/2). Beide Proteine sind mit der Proliferation assoziiert. Es konnte jedoch kein Effekt des TRPC1 knockouts auf die durch chronische Hypoxie-induzierten Änderungen in der Expression von Ki67, Cyclin D1 und alpha-SMA sowie der Phosphorylierung von p38 und Erk1/2 beobachtet werden. Weiterführend wurde gezeigt, dass TRPC1 die Ca2+-Homöostase unter chronischer Hypoxie als Rezeptor-aktivierter Kanal beeinflusst. Im upstream-Signalweg wurde der hypoxie-induzierbare Faktor (HIF)-1alpha als Schlüsselprotein in der Regulation der TRPC1-Expression identifiziert, indem der knockdown von HIF-1a zu einer Inhibition der chronisch Hypoxie-induzierten TRPC1 mRNA-Expression führte. Des Weiteren wurde die Fähigkeit einiger Wachstumsfaktoren die Expression von TRPC1 zu induzieren untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass der transformierende Wachstumsfaktor (transforming growth factor, TGF)-beta1 die Expression von TRPC1 induziert, während der Tumornekrosefaktor alpha diese inhibiert. Schließlich konnte aufgeklärt werden, dass TGF-beta1 eine stabilisierende Wirkung auf HIF-1alpha hatte und zu einer erhöhten TRPC1-Expression führte.Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit TRPC1 durch in vivo und in vitro Untersuchungen als bedeutendes Kationenkanal-bildendes Protein identifiziert werden, welches in dem pathophysiologischen Mechanismus der CHPH involviert ist, in dem es Einfluss auf das Migrations- und Proliferationsverhalten der PASMC nimmt. Zukünftig könnte TRPC1 also als neues therapeutisches target von Bedeutung sein. Pulmonary hypertension (PH) is a collective term of severe diseases characterised by pulmonary vascular remodelling leading to elevated vascular resistance and pulmonary arterial pressure. The remodelling process is caused by an increased proliferation and migration as well as a reduced apoptosis of pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMC). The intracellular Ca2+ concentration is essential for PASMC proliferation and migration. However, the role of Ca2+-channels in PH needs to be further investigated. The subfamily of classic transient receptor potential (TRPC) channels which belong to the family of non-selective cation channels are promising candidates. The aim of this scientific study was to identify and to characterise possible key TRPC proteins involved in the pathomechanism of chronic hypoxia-induced PH (CHPH). The mRNA expression of TRPC1 was upregulated by chronic hypoxia in mouse, rat and human PASMC. The mRNA expression of TRPC3 and TRPC4 was reduced whereas the mRNA expression of TRPC5, TRPC6 and TRPC7 was unchanged. TRPC1 knockout mice kept under chronic hypoxia possesed reduced vascular remodelling and right ventricular systolic pressure suggesting that TRPC1 knockout mice were partly protected from CHPH developement. However, the loss of TRPC1 showed no influence on hypoxic pulmonary vasoconstriction during acute and sustained hypoxia in the model of an isolated, ventilated and blood free perfused lung. Furthermore, the influence of TRPC1 on proliferation, migration and apoptosis of murine PASMC was characterised. The knockout and the knockdown of TRPC1 led to a reduced chronic hypoxia-induced proliferation. The knockout of TRPC1 caused a full inhibition of chronic hypoxia-induced migration. The analysis of the downstream signaling pathway revealed the induction of the proliferative markers ki67 and cyclin D1. Additionally, chronic hypoxia caused a reduced expression of alpha-smooth muscle actin (alpha-SMA) which is associated with the change from the contractile phenotype to a proliferative phenotype. Moreover, chronic hypoxia led to phosphorylation of p38 but not extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (Erk1/2), both associated with proliferation. Interestingly, the TRPC1 knockout had no effect on the expression of ki67, cyclin D1 and alpha-SMA as well as on the phosphorylation of both kinases. Furthermore, TRPC1 influenced the Ca2+ homeostasis under chronic hypoxia and was identified as a receptor-activated channel. In the upstream signaling pathway hypoxia-induced factor (HIF)-1alpha was identified as a key protein in the regulation of TRPC1 expression. In this regard, the knockdown of HIF-1alpha caused an inhibition of the chronic hypoxia-induced TRPC1 mRNA expression. The ability of different growth factors to induce TRPC1 mRNA expression was analysed, too. These data showed that transforming growth factor (TGF)-beta1 was able to induce TRPC1 expression but tumor necrosis factor alpha inhibit TRPC1 expression. Finally, TGF-beta1 showed a stabilising effect on HIF-1alpha and led to TRPC1 mRNA expression.In summary, TRPC1 was identified as an outstanding cation channel forming protein which played an important functional role in the proliferation and the migration of murine PASMC, contributing to the development of CHPH. In future, TRPC1 might be a potential new target for therapeutic approaches.