Etablierung des Einsatzes von formalin-fixiertem paraffin-eingebettetem Gewebe (FFPE-Gewebe) zur Antikörper-Selektion mittels der Phage-Display-Methode am Beispiel des kleinzelligen Bronchialkarzinoms (SCLC)

Abstract

Das kleinzellige Bronchialkarzinom (SCLC) metastasiert früh und ist durch einen aggressiven Verlauf gekennzeichnet, der mit 2-Jahres-Überlebensraten von unter fünf Prozent einhergeht. In der Therapie von malignen Erkrankung werden immer häufiger monoklonale Antikörper als spezifische Therapeutika verwendet. Beim nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom konnten damit schon vielversprechende Erfolge erzielt werden, die bisher beim SCLC jedoch nicht bestätigt werden konnten. Ein effektives in vitro Herstellungsverfahren für diese Antikörper ist die in dieser Arbeit verwendete Phage-Display-Technologie. Die Methode basiert auf der Expression von funktionellen Antikörperfragmenten auf der Oberfläche von Bakteriophagen, die dann anhand ihres Antigen-Bindungsverhalten isoliert werden können. Für Standardselektionsverfahren werden Zelllinien oder aufgereinigte Antigene verwendet, bei denen die Antigene jedoch nicht in ihrer natürlichen Umgebung vorliegen. In dieser Arbeit fanden die Selektionen auf FFPE-Gewebeschnitten, also auf komplexen Antigenstrukturen in ihrer natürlichen Umgebung statt. Da es sich hier um Material handelt, dass im Rahmen einer Routinediagnostik gewonnen wurde, kam es nicht zu einer zusätzlichen Belastung für den Patienten. Zunächst wurden verschiedene Antigendemaskierungsverfahren angewendet, um die Zugänglichkeit und damit die Immunogenität der Epitope zu erhöhen. Dann wurde mit den scFv-Antikörper-Bibliotheken Tomlinson I und J zunächst auf gesundem Lungengewebe depletiert, um tumorirrelevante Antikörper zu entfernen, bevor sie zur Selektion auf SCLC-Gewebe gegeben wurden. Auf diese Weise konnten vier Antikörper gewonnen werden, deren SCLC-Spezifität mittels ELISA und Durchflusszytometrie auf drei SCLC-Zelllinien (NCI-H69, NCI-H82 und DMS273) bestätigt werden konnte. Die Selektion auf den Gewebeschnitten ermöglicht also die effektive Gewinnung von Antikörpern, die spezifisch auf den Patienten zugeschnitten ist. Ein mögliches diagnostisches oder therapeutisches Potential gilt es in weiteren Versuchen zu analysieren. Small cell lung cancer (SCLC) metastasizes early and is characterized by its aggressive progression that goes along with a two-year-survival rate of less than five percent. In effective in vitro manufacturing process for these antibodies is the Phage-Display-Technology which was used in this study. The method is based on the expression of functional antibody-fragments on the surface of bacteriophages which then could be isolated on the basis of their way of antigen binding. Usually cell lines or purified antigens are used for standard selection procedures, but the antigens are then not given in their natural environment. In this study the selection procedure was carried out on FFPE-slides which contain complex antigen-structures which are in their natural environment. These slides were obtained from standard diagnosis-material. So there was no additional stress for the patients. At first different epitope retrieval procedures were applied to enhance antigen accessibility and immunogenicity. After that the scFv antibody libraries Tomlinson I and J were depleted on healthy lung tissue, to minimize tumor-irrelevant antibodies. Then the selection procedure was performed on SCLC tissue-slides. Hereby we could isolate four antibodies, whose SCLC-specifity was confirmed by ELISA and flow cytometry using SCLC-cell lines (NCI-H69, NCI-H82 and DMS273). According to that the selection on tissue slides enables an effective production of antibodies which are specifically designed for the individual patient. A possible diagnostic or therapeutic potential should be investigated in follow-up studies.