Das Selenoprotein Thioredoxinreduktase : funktionelle und strukturelle Charakterisierung von humanen Disulfidreduktasen als potentielle Zielmoleküle von Chemotherapeutika
Die im Säugerorganismus als Selenocystein-haltiges Enzym vorkommende homodimere Thioredoxinreduktase ist zusammen mit der Glutathionreduktase zentraler Bestandteil des zellulären Thiolmetabolismus, der über die antioxidative Abwehr hinaus auch an der Redoxregulation intra- und extrazellulärer Prozesse beteiligt ist. Das Thioredoxin- und das Glutathionsystem arbeiten in verschiedenen Organismen als parallele, sich ergänzende oder aber auch als sich ersetzende Systeme.
In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Beiträge zur biochemischen und kristallographischen Charakterisierung der Flavoproteine Thioredoxinreduktase und Gluta-thionreduktase im Hinblick auf ihr Potential als Zielmoleküle neu entwickelter Disulfid-reduktaseinhibitoren geleistet. Die Inhibitorstudien wurden durch Studien an verschiedenen TrxR-Mutanten, weiterführenden differentiellen Genom- und Proteomanalysen sowie Studien am Tiermodell komplementiert.
Für die TrxR-Studien wurden rekombinante und native TrxR aus humaner Plazenta verwendet. Zur Gewinnung der nativen TrxR aus Plazenta wurde ein etabliertes Aufreinigungsverfahren angewendet und weiter optimiert. Im heterologen System konnten TrxR-Mutanten ohne Selenocystein in ausreichenden Mengen exprimiert werden. Diese bestanden in einer am C-terminalen Selenocystein mutierten TrxR-Mutante sowie in anderen, C-terminal-verkürzten TrxR-Mutanten und wurden auf Substratspezifität und Katalyse-eigenschaften untersucht. Trotz ihrer homologen Bereiche in den Substratbindungsregionen sind die TrxR und GR nicht ineinander zu überführen. Die Cysteinmutante der hTrxR wurde vergleichend zum Selenocystein-Wildtyp charakterisiert. Trotz einer sonst geringen Aktivität mit den üblichen Substraten Trx und DTNB erwies sie sich als potentes Enzym in der Menadionreduktion (kcat/KM = 7.4 ± 1.5 · 106 M-1· min-1) in vitro und im Zusammenhang mit einem induzierten Lipid-Transfer in die Zelle als apoptoseauslösend.
Die Kristallisation der humanen TrxR stand ebenfalls im Mittelpunkt dieser Dissertation. Es gelang, hochwertige Einkristalle der Cysteinmutante der TrxR zu produzieren, von der erste Röntgenstrukturdaten bis 2.9 Å gewonnen werden konnten.
Die erste im Rahmen der vorliegenden Arbeit getestete Inhibitorklasse setzte sich aus an Nitrofurancarbonhydrazid gekoppelten Cis-Diamindichlorplatin-Komplexen (CDDP-Kom-plexe) zusammen. Die CDDP-Komplexe erwiesen sich in enzymatischen in vitro-Unter-suchungen als irreversible und selektive Inhibitoren der NADPH-reduzierten TrxR im nanomolaren Konzentrationsbereich, mit maximalen Geschwindigkeitskonstanten ki um 1 min-1 in Kinetiken pseudo-erster Ordnung. Zellkulturexperimente und DNA-Interaktions-studien bestätigten, dass die TrxR-Hemmung der CDDP-Komplexe einen bedeutenden Beitrag zur Toxizität in Tumorzellen leisten kann (Millet et al., 2005).
Die bekannten in vitro-Eigenschaften der Inhibitorklasse der 2,2':6',2''-Terpyridinplatin(II)-Komplexe sollten in dieser Dissertation in vivo in einem Glioblastom-Rattenmodell untersucht werden. Die in Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum Heidelberg durchgeführten Tierversuchsreihen mit verschiedenen Therapiemodellen und MRI-Aus-wertungen wurden durch Messungen verschiedener biochemischer, insbesondere redox-chemischer Parameter in den Geweben der Ratten ergänzt. Es ergaben sich gewebe-spezifische Veränderungen in der Redoxaktivität mit einer spezifischen TrxR-Hemmung im Tumorgewebe, die aber nicht mit der Auslösung der apoptotischen Kaskade einhergingen. Genom- sowie Proteomanalysen von behandelten Glioblastomzellen weisen auf einen chemotherapeutisch induzierten Zellzyklusarrest hin. (Urig et al., 2005; Ahmadi et al., 2005).
Das Inhibitorpotential zweier Platin- und zweier Goldphosphol-Komplexe konnte in intensiven Kinetikstudien an der TrxR und der GR bestätigt werden, mit einer deutlichen Präferenz der Platin-Phospholkomplexe für die TrxR. Gold-Phospholkomplexe sind sehr effiziente Inhibitoren beider Disulfidreduktasen im unteren nanomolaren Bereich und gehen nach einer ersten kompetitiven Kinetik sehr schnell in die irreversible Phase zur kovalenten Modifikation der Enzyme über. Es gelang im Rahmen dieser Arbeit, einen hGR-Phosphol-Komplex zu kristallisieren und seine Röntgenstruktur bei 2.6 Å zu lösen. Die lineare S-Au-S-Geometrie zwischen den Cysteinen im aktiven Zentrum der hGR konnte zum ersten Mal in einer Proteinstruktur beobachtet werden (Urig et al., in press; Koncarevic et al., 2005; Deponte et al., 2005).
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