Digital gene expression analysis during seedling development of complex traits in winter oilseed rape (Brassica napus L.)

Abstract

A more efficient digital gene expression (DGE) method to produce sequencing data by multiplexing from a large plant population of winter oilseed rape (Brassica napus L.) was created. Subsequently, DGE analysis to identify candidate regulatory genes associated with complex traits during seedling development was performed. Seedling vigour is an important trait due to its influence on seedling establishment before winter and the consequent effects on yield and yield stability. The multiplexed-DGE analysis was proved to be a cost-effective method for large-scale quantitative transcriptome analysis, using next-generation Illumina (Solexa) sequencing. The normalised DGE data with barcode multiplexed indexing could then be successfully applied to weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) together with an integration of phenotypic and metabolic hormone data. A bulked-segregant analysis (BSA)-DGE approach was used in this study. For each of the investigated traits, 20 best and 20 worst performing individuals, respectively, were assigned to bulks with significant phenotypic variance. The bulked DH lines segregate strongly for numerous complex quantitative traits, e.g. development, vigour, flowering, and yield components. A number of significantly differentially expressed genes could be identified. The regulatory gene CLV1 (CLAVATA 1) was found to be differentially expressed for traits such as shoot fresh weight and plant height at flowering for year 2006. This suggests its role as regulatory component of the molecular network controlling shoot meristem activity in winter oilseed rape. In addition, the genes NIP (NOD26-LIKE INTRINSIC PROTEIN), LHCB3 (LIGHT HARVESTING CHLOROPHYLL B BINDING PROTEIN 3), TT7 (TRANSPARENT TESTA 7) and CRU2 (CRUCIFERIN 2) were significantly differentially expressed for the seed yield trait for years 2006 and 2007. Interestingly, NIP, which belongs to the aquaporin superfamily and is plant-specific, was found to be differentialy expressed at both 8 and 12 DAS. The expression of NIP in WOSR indicates a wide range of function that may include a greater range in selectivity. The LHCB3 gene is a component of the main light harvesting chlorophyll a/b-protein complex of Photosystem II (PSII) and is therefore very important during the photosynthetic process. CRU2 belongs to an important group of seed storage proteins in Brassica napus, the 12S globulin complex, and is synthesized during seed development. In addition, a total of fifteen Top Hub Brassica Unigenes for A (B. rapa) and C (B. oleracea) genomes were identified as candidate regulatory genes for complex trait interaction during seedling development. Annotation of these Top Hub Unigenes with Arabidopsis thaliana genome (by BLASTX, TAIR 10 and agriGO) was performed to determine gene functions and they could be related to leaf and shoot system development, cytokinin pathway and circadian clock. The transcription activators GRF1 (GROWTH REGULATING FACTOR 1), UBP15 (UBIQUITIN-SPECIFIC PROTEASE 15), and VPS2 (VACUOLAR PROTEIN SORTING 2) were found to play a key role in leaf and shoot system development. Furthermore, GF14 (G BOX FACTOR 14-3-3 OMEGA) also known as GRF2 was identified within the co-expression network interacting almost all aspects of plant growth and development, including hormonal metabolism and gene transcription. These results gave an insight into the genetic regulation of complex traits, providing some candidate genes and allowing to some extent an interpretation of their regulatory role. The DGE data presented in this study comprise a novel basis for further genetical genomics approaches, e.g. eQTL, gene isolation, functional validation, and development of gene expression markers (GEMs). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine verbesserte Multiplex-Methodik der Digitalen Genexpressionsanalyse (DGE) anhand einer großen Winterraps-Population (Brassica napus L.) etabliert. Die DGE-Analyse wurde eingesetzt, um Kandidaten für regulatorische Gene von komplexen Merkmalen der Keimlingsentwicklung zu identifizieren. Die Keimlingsentwicklung ist ein wichtiges Entwicklungsstadium wegen seiner Rolle für die Etablierung der Pflanzen vor Winter und damit die Ertragsbildung und Ertragstabilität. Wie nachgewiesen werden konnte, stellt die Multiplex-DGE Analyse eine nützliche Methode für die quantitative Hochdurchsatz-Transkriptom-Analyse ( Next-Generation Illumina Sequenzierung) dar. Anhand der DGE-Daten konnte mithilfe von Multiplex-Barcodes und durch Integration von phänotypischen und metabolischen Hormondaten eine Genkoexpressions-Netzwerkanalyse erfolgreich durchgeführt werden. Ferner wurde eine bulked segregant analysis (BSA) durchgeführt und mit den Ergebnissen der DGE-Analyse verglichen. Für jedes der untersuchten Merkmale wurden die 20 Genotypen (DH-Linien) mit der höchsten sowie 20 Genotypen mit der niedrigsten Merkmalsausprägung (größte phänotypische Abweichung gemäß simple t-test, p < 0.05) zwei extremen Gruppen zugeordnet. Die -Linien-Bulks differenzierten stark für zahlreiche komplexe quantitative Merkmale, z.B. Sprossfrischgewicht, Blühzeit und Samenertrag. Mehrere differentiell exprimierte Gene konnten identifiziert werden. Das Gen CLAVATA 1 (CLV1) erwies sich als involviert in Merkmale wie Sprossfrischgewicht, Pflanzenhöhe und Blühzeitpunkt. CLV1 besteht zum einen aus einer extrazellulären Domäne die sich aus wiederholenden Leucin-reichen Motiven zusammensetzt und für eine Interaktion von Rezeptor und Ligand sorgen könnte. Eine Rolle von CLV1 als regulatorische Komponente im apikalen Sprossmeristem von Winterraps konnte festgestellt werden. Die Gene NIP (NOD26-LIKE INTRINSIC PROTEIN), LIGHT HARVESTING CHLOROPHYLL B BINDING PROTEIN 3 (LHCB3), TRANSPARENT TESTA 7 (TT7) und CRUCIFERIN 2 (CRU2) wurden differentiell exprimiert für das komplexe Merkmale Samenertrag. Das Gen LHCB3 ist ein Bestandteil des Chlorophyll a/b-Protein-Komplexes im Photosystem II (PSII) und ist deshalb relevant im Photosynthese-Prozess. Ferner gehört das Gen CRU2 zum 12S-Globulin-Komplex, einer wichtigen Gruppe von Samenvorratssproteinen in B. napus, die während der Samenentwicklung synthetisiert werden. Insgesamt fünfzehn Schlüsselgene (Unigene) wurden im Brassica A-Genom (B. rapa) und C-Genom (B. oleracea) als regulatorische Kandidatengene für Komplexmerkmale der Keimlingsentwicklung identifiziert. Es wurde eine Annotation dieser Top Hub Unigene anhand des Genoms von Arabidopsis thaliana durchgeführt, um Genfunktionen zu identifizieren. Manche Gene erscheinen gleichermaßen involviert in die Sprosssystementwicklung, den Cytokinin-Stoffwechsel und den circadianen Rhythmus. Wie die Ergebnisse andeuten, haben die Transkiptsionsaktivatoren GROWTH REGULATING FACTOR 1 (GRF1), UBIQUITIN-SPECIFIC PROTEASE 15 (UBP15), und VACUOLAR PROTEIN SORTING 2 (VPS2) eine Schlüsselrolle für die Blatt- und Sprosssystem-Entwicklung. Außerdem wurde der Transkriptionsfaktor G BOX FACTOR 14-3-3 OMEGA, auch bekannt als GRF2 (GF14), als Komponente des Gen-Koexpressionsnetzwerks identifiziert, der in viele Vorgänge des Pflanzenwachstums und der Entwicklung, einschließlich der hormonellen Regulation und Gen-Transkiption involviert ist. Die vorliegenden Ergebnisse geben wichtige Hinweise auf die genetische Regulierung von komplexen Leistungsmerkmalen. Es wurden Kandidatengene identifiziert, deren regulatorische Rolle nun weiterer Interpretation bedarf. Die in dieser Studie präsentierten Daten aus der DGE bilden eine Basis für weitere zielführende Ansätze des Genetical Genomics , wie z.B. eQTL, Genisolierung, funktionelle Genanalyse und Entwicklung von Gen-expression Markern.