Charakterisierung der Interaktion von K-Ras mit Galektin-8 und deren Einfluss auf die Signaltransduktion von Karzinomzellen

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2015

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10334

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Aktivierende, onkogene Punktmutationen in ras Genen treten in 30 % aller humanen Tumoren auf. K-ras weist die höchste Mutationsrate auf und betrifft 90 % aller Pankreaskarzinome. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion zwischen K-Ras und Galektin-8, einem in der Arbeitsgruppe identifizierten Interaktionspartner, sowie der Einfluss von Galektin-8 auf die Aktivität der Kinasen Akt und ERK und auf die K-Ras-induzierte Migration untersucht. In HEK293 Zellen konnte Galektin-8 mit EGFP-K-Ras(G12V) und EGFP-K-Ras(S17N) nach ektoper Expression der Proteine ko-immunpräzipitiert werden. Dies zeigt, dass K-Ras unabhängig seines Aktivierungszustandes mit Galektin-8 interagiert. Das Fehlen der posttranslationalen Farnesylierung von K-Ras hingegen führte dazu, dass Galektin-8 nicht im Komplex mit K-Ras ko-immunpräzipitiert wurde. Mit diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Farnesylgruppe für die Interaktion von K-Ras mit Galektin-8 essentiell ist. Daraus ergab sich die Frage, welche strukturellen Eigenschaften in Galektin-8 für die Bindung der Farnesylgruppe verantwortlich sein könnten. Durch in silico Analysen der Sekundärstrukturen der Galektin-8 N- bzw. C-terminalen CRD wurden Bereiche identifiziert, die hydrophobe Bindungstaschen für die Farnesylgruppe des K-Ras ausbilden könnten. Diese Taschen beinhalten 6 Aminosäuren, von denen bekannt ist, dass sie für die Interaktion der Farnesylgruppe des H-Ras mit der hydrophoben Tasche von Galektin-1 von Bedeutung sind. Neben der Interaktion mit K-Ras wurde die Regulierung des Galektin-8 Proteingehalts in PANC-1 Zellen analysiert. Durch die Inkubation der Zellen mit pharmakologischen Inhibitoren, die die Phosphorylierung der Kinasen MEK1, MEK2, PI3K, Akt und mTOR oder die katalytische Aktivität von p38 hemmten konnte gezeigt werden, dass die Expression von Galektin-8 durch den MEK/ERK- und mTOR-Signaltransduktionsweg reguliert wird.In der Transformation verschiedener Zelltypen und Tumorgenese spielen die Ras-abhängigen Signaltransduktionswege Raf/MEK/ERK und PI3K/Akt eine bedeutende Rolle. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Galektin-8 auf die Phosphorylierung von Akt2 und ERK1/2 in PANC-1 Pankreaskarzinomzellen untersucht. Die siRNA-vermittelte Inhibierung der Galektin-8 Expression resultierte in einer gesteigerten Phosphorylierung von Akt2 und ERK1/2, während eine reduzierte Galektin-3 Expression die Phosphorylierung von ERK1/2 erhöhte, aber keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von Akt2 hatte. Die stabile Expression von EGFP-K-Ras(G12V) verstärkte die Phosphorylierung von Akt2 in Zellen, die mit siRNAs gegen Galektin-8 und -3 transfiziert worden waren. Die Überexpression von ECFP-Galektin-8 führte zu keiner veränderten EGFP-K-Ras(G12V)-induzierten HA-ERK2 Phosphorylierung.In den Lungenadenokarzinomzelllinien A549 und A427 führte eine verminderte Galektin-8 Expression durch siRNAs zu keiner Änderung der Phosphorylierung von Akt1 und ERK1/2. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass in diesen Zellen weder der PI3K/Akt- noch der Raf/MEK/ERK-Signalweg durch Galektin-8 reguliert wird.Um den Einfluss von Galektin-8 auf die Migration von PANC-1 Zellen zu untersuchen, wurden Wounding-Assays durchgeführt. Zellen, die zuvor mit Gal-8 siRNAs transfiziert worden waren, zeigten einen um 20-25 % verringerten Wundverschluss verglichen mit Zellen, die mit einer Kontroll-siRNA transfiziert worden waren. In Immunoblotanalysen nach subzellulären Fraktionierungsexperimenten von PANC-1/EGFP-K-Ras(G12V) Zellen wurden endogenes Galektin-8 und Ras sowie EGFP-K-Ras(G12V) in der partikulären Fraktion detektiert. Die Membranlokalisierung konnte fluoreszenzmikroskopisch für EGFP-K-Ras(G12V), nicht aber für ektopes ECFP-Galektin-8 bestätigt werden.In der vorliegenden Arbeit konnte die Relevanz der Farnesylgruppe für die Interaktion zwischen K-Ras und Galektin-8 sowie die Auswirkungen von Galektin-8 als Regulator der K-Ras-induzierte Phosphorylierung von Akt und ERK als auch auf die Migration von PANC-1 Zellen beschrieben werden.

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