Die zielgerichtete Integration eines therapeutischen Gens ist eine viel versprechende Möglichkeit der Gentherapie, um vererbte oder erworbene monogenetische Krankheiten heilen zu können. In den letzten Jahren wurden verschiedene TALE-, Zinkfinger- und Meganukleasen entwickelt, die einen adressierten DSB in die genomische DNA einfügen können. Durch die hochspezifische Spaltung mittels generierter Designernukleasen wird das wirtseigene Reparatursystem der HDR ausgelöst. Steht eine exogen eingefügte DNA zur Verfügung, kann das defekte Gen zielgerichtet ausgetauscht werden. HE sind natürlich vorkommende Endonukleasen mit sehr langen Erkennungssequenzen von 14-40 Bp. Durch die Möglichkeit des Protein engineering können nicht nur bestimmte Eigenschaften wie die Spezifität und Aktivität der Enzyme verändert werden, sondern auch die Erkennung von neuen Zielsequenzen herbeigeführt werden.In dieser Arbeit wurden dazu zwei verschiedene Ansätze von engineering an LAGLIDADG-HE verfolgt. Zum einen wurde das Fusionsprotein Sce*2Cre* so weiterentwickelt, dass es auch unter physiologischen Bedingungen seine Erkennungssequenz spezifisch spalten kann. Das Enzym besteht in der dimeren Form aus der Fusion einer I CreI Variante (G19S), die von zwei inaktiven I-SceI Varianten (D44N/D145A) flankiert wird. Durch weitere Mutationen in der I-Cre* Spaltdomäne konnte Sce*2Cre*K139M;Y33C hergestellt werden. Dieses Enzym spaltet zwar die Zielsequenz unter physiologischen Bedingungen adressiert bzw. spezifisch , hat aber im Vergleich zum Wt Sce*2Cre* an Aktivität verloren. Weitere Tests zeigten, dass diese geringe Aktivität wahrscheinlich auf die kaum vorhandene Bindungsstärke der Spaltdomäne zurückzuführen ist und so lediglich die I-Sce*-Bindungsdomänen des Fusionsproteins für die Bindung essentiell sind. Dadurch könnten zwei DNA Fragmente auf einmal gebunden werden, was das Enzym in die Inaktivität führt. Um das erzeugte Fusionsprotein in der Gentherapie anwenden zu können, müsste es weiter verändert werden, was sehr zeitaufwendig ist. Da TALEN wesentlich einfacher und schneller zu programmieren sind, werden diese Nukleasen zukünftig eher in der Therapie am Genom des Menschen eingesetzt werden. Das in dieser Arbeit hergestellte Sce*2Cre*K139M;Y33C wäre aber ein optimaler Kandidat um dessen Erkennungssequenz in vivo eine sogenannte safe harbour -Stelle zu spalten. Denn mittlerweile werden I-SceI Erkennungssequenzen als Insertionsstellen für genetische Modifikationen in einer Auswahl von bestimmten Kulturpflanzen angewendet.Zum anderen wurde in dieser Arbeit ein Bindungs-Assay entwickelt, der noch nicht ausgereift ist und durch weitere Untersuchungen auf seine Effizienz getestet werden könnte. Der Bindungs-Assay besteht aus einem Zwei-Plasmidsystem (Endo- sowie Target-Plasmid) und ist an eine blau/weiß-Selektion angelehnt. Das Endo-Plasmid kodiert für die inaktive I-CreI-Variante (I-Cret) oder eine Variante davon. Das Target Plasmid beinhaltet das lac-Operon mit einer I-CreI-Erkennungssequenz anstelle des Repressorgens. Wird eine Enzymvariante mit hoher Affinität zur Zielsequenz exprimiert, bleiben die E. coli-Zellen weiß. Wird dagegen eine Variante mit niedriger Affinität hergestellt wird beta-Galaktosidase exprimiert und die Zellen färben sich blau. Durch Analysen verschiedener Eigenschaften von Endo- und Target-Plasmiden mit den dazugehörigen Kontrollen konnte durch Kotransformation des high copy Target Plasmids mit dem middle copy Endo-Plasmid auf den Selektionsagarplatten 80/0,6 das gewünschte Ergebnis erzielt werden. Doch hat sich der Bindungs-Assay in weiteren Untersuchungen als nicht robust erwiesen und es müssten, um die Funktion des Assays verifizieren zu können, weitere Analysen durchgeführt werden.
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