HSV/AAV-Hybridamplikonvektoren zur stabilen Transduktion humaner Zellen
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Humane hämatopoetische und mesenchymale Stammzellen sind attraktive Zielzellen für die Gentherapie. Eines der Hauptprobleme des stabilen Gentransfers in Zellen ist die durch zufällige chromosomale Integration verursachte maligne Transformation. Die adeno-assoziierten Viren (AAV) sind die einzigen integrierenden Viren, die eine spezifische Integration vermitteln. In den vergangenen Jahren wurden hybride HSV/AAV- Amplikonvektoren entwickelt, die Elemente der Herpes simplex Viren-Typ 1 (HSV-1) und der AAV-Typ 2 miteinander vereinen. Die große Verpackungskapazität des HSV- Amplikonvektors ermöglicht die Verpackung der essentiellen AAV-Elemente für die spezifische Integration und des Transgens in cis im gleichen Vektor. Verpackt in die herpesvirale Hülle transduzieren die Vektoren mit hoher Effizienz. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zunächst einleitende Transduktionsexperimente mit dem HSV/AAV-Hybridamplikonvektor HSV/AAV durchgeführt, welcher das grüne Fluoreszenzprotein (GFP) exprimiert, das zwischen den AAV-ITRs lokalisiert ist. Nach Transduktion verschiedener lymphohämatopoetischer Zelllinien konnte die höchste Transduktionseffizienz von ca. 70% in der den Stammzellen am nächsten stehenden humanen myeloischen Leukämiezelllinie KG1a beobachtet werden. In der humanen T-Zell-Leukämiezelllinie Jurkat lag die Transduktionseffizienz nach Transduktion mit der gleichen Vektormenge bei ca. 40%. Die Transgenexpression war in beiden Zelllinen nach der Transduktionüber 6 Tage stabil und nahm dann zügig ab. In der humanen Nierenzelllinie 293, die als Modellzelllinie zur Integrationsanalyse eingesetzt wurde, lag die Transgenexpression nach Transduktion mit dem HSV/AAV-Hybridamplikonvektor HSV/AAV am 91. Tag nach der Transduktion noch bei annähernd 30%. Es gelang nach Transduktion der humanen Nierenzelllinie 293 mit HSV/AAV stabile 293-Einzelzellklone zu kultivieren und in 2 der ausgewählten hochexprimierenden GFP+-Klone eine spezifische Integration in die AAVS1-site des humanen Chromosoms 19 darzustellen. In humanen hämatopoetischen CD34+-Stammzellen ließ sich eine Gentransferrate von 20% erzielen. Nach 10 Tagen lag die Transgenexpression zwar nur bei 1 bis 2% der Zellpopulation, jedoch verdreifachte sich die absolute Anzahl an GFP exprimierenden CD34+-Zellen aufgrund der Proliferation der CD34+-Zellen..Neben den hämatopoetischen CD34+-Stammzellen wurden mesenchymale Stammzellen (MSZ) untersucht. Nach Transduktion der MSZ mit dem HSV/AAV-Hybridamplikonvektor HSV/AAV konnte eine hohe Transduktionsrate von ca. 90% mit einer niedrigen Zielzelltoxizität erreicht werden. Nach 15 Tagen konnte nach Transduktion mit dem HSV/AAV noch eine Transgenexpression von 22% gezeigt werden, die bis zum 33. Tag bei 3 bis 4 % lag. Zusammengefasst zeigten diese Daten, dass hybride HSV/AAV-Amplikonvektoren mindestens über 2 Wochen anhaltende stabile Transgenexpression in hämatopoetischen und mesenchymalen Stammzellen ermöglichen.Link to publications or other datasets
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Giessen : VVB Laufersweiler 2007