Entwicklung real-time-PCR-basierter Methoden für die moderne DNA-Analytik

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2003

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-9964

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Die molekulare DNA-Analytik ist von großer Bedeutung für die biologische und medizinische Forschung sowie zunehmend auch für die klinische Diagnostik. Hier bieten real-time-PCR-basierte Verfahren neue Möglichkeiten der schnellen und verlässlichen Quantifizierung genetischer Elemente und der einfachen Mutationsdetektion. Die vorliegende Arbeit behandelt einen Querschnitt durch das Spektrum der real-time-PCR-basiertern DNA-Analytik und gibt einen umfassenden Überblick über die theoretischen und biochemischen Grundlagen, zeigt die Einsatzmöglichkeiten für DNA-analytische Fragestellungen und stellt neue methodische Entwicklungen vor, die neue Standards bzw. Grenzen für Genauigkeit und Dynamik setzen. Die systematische Untersuchung der Einflüsse biochemischer und technischer Parameter auf das Ergebnis von Messungen in Kombination mit Analysen theoretischer Modelle der Real-time-PCR-Prozesse erlaubt erstmals die Bestimmung möglicher Schwachstellen sowie der Grenzen für Präzision und Genauigkeit von Analysesystemen. So konnte gezeigt werden, dass die theoretisch erreichbare Genauigkeit von Quantifizierungen über CT-Werte des hier verwendeten LightCyclers bei etwa 10 % liegt. Durch die Verwendung neuer, in dieser Arbeit entwickelter Algorithmen zur Datenauswertung wird diese theoretische Grenze nahezu erreicht: Die Fehler können von mehr als 50 % nach konventioneller Auswertung auf deutlich unter 15 % gesenkt werden. Die Anwendung dieser Verfahren wurde an drei ausgewählten Fragestellungen mit tumordiagnostischem Fokus demonstriert (XIR-2, HER-2/neu und p53), die sehr unterschiedliche Ansprüche an den dynamischen Bereich und die Präzision der Quantifizierung stellen. Dabei übertrifft insbesondere die Genauigkeit des Verfahrens zur Bestimmung des Deletionsgrades von p53-Genkopien jene von anderen analytischen Methoden deutlich. Bereits der Verlust eines der beiden Allele in lediglich 25 % der Zellen einer Probe kann hochsignifikant nachgewiesen werden.Die Algorithmen zur quantitativen Auswertung von Real-time-PCR-Daten erlauben erstmals eine optimale und vollautomatische Auswertung. Durch ein hier erstmals beschriebenes Verfahren zur Korrektur temperaturabhängiger Signaländerungen konnten die Sensitivität und die Genauigkeit von Schmelzkurvenanalysen beträchtlich erhöht werden. Die beschriebenen Algorithmen wurden in einer neuen, sehr anwenderfreundlichen Software (SoFAR) implementiert. Schließlich werden mehrere neuartige Verfahren zum Einsatz der Real-time-PCR vorgestellt: Ein Verfahren erlaubt die sehr genaue Bestimmung von Genomgrößen, wie am Beispiel von S. cerevisiae (12.1 MBp), H. sapiens (2.9 GBp) und X. maculatus (551 MBp) gezeigt ist. Ein weiteres Verfahren beruht auf einer allelspezifischen Real-time-PCR und kann zur einfachen Genotypisierung sowie zur Chimärenanalytik eingesetzt werden, wie am Beispiel der klinisch relevanten SNPs von PAI-1 und F7c gezeigt. Die erreichten dynamischen Bereiche zur Unterscheidung kleiner Polymorphismen sind hier über 100mal größer als die konventioneller Verfahren. Mit dem neuen Verfahren zur kompetitiven Real-time-PCR sind hochgenaue Konzentrationsbestimmungen möglich. Mit dieser Methode wurde die Menge der cDNA von BCR/ABL-Fusionstranskripten in Einzelbestimmungen mit einem Fehler von weniger als 3 % bestimmt.Die Ergebnisse dieser Arbeit steigern die Leistungsfähigkeit, Verlässlichkeit und Genauigkeit der Ergebnisse von Real-time-PCR-Experimenten und erweitern die möglichen Anwendungsbereiche der Real-time-PCR für DNA-analytische Fragestellungen. Die entwickelten Verfahren bereichern das methodische Arsenal der molekularen Genetik und Medizin.

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