Periurethrale Injektion adulter mesenchymaler Stammzellen als neuer Therapieansatz zur Behandlung der Belastungsinkontinenz im Rattenmodell
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Zusammenfassung
Belastungsinkontinenz wird durch morphologische und funktionale Defekte des Harnblasensphinkters durch Operationen oder vaginale Geburten sowie durch eine mit dem Lebensalter korrelierte Abnahme von Zellen des Rhabdosphinkters infolge physiologischer Apoptose verursacht. Mesenchymale Stammzellen (MSZ) haben das Potential, in Muskelzellen zu differenzieren. Sie sind deshalb für eine zellbasierte Therapie der Belastungsinkontinenz von Interesse. Das Ziel der Studie sind Untersuchungen an murinen MSZ (mMSZ) und humanen MSZ (hMSZ) aus dem Knochenmark zur myogenen Differenzierung in vitro und zur Integration von in den Blasenhals transplantierten MSZ bzw. hieraus differenzierten Muskelzellen in einem syngenen und xenogenen Rattenmodell. Nach Isolierung von mMSZ aus dem Knochenmark durch Plastikadhärenz werden diese in Passage (P) 1 für die Induktion myogener Zellen 24 Stunden gegenüber 5-Azazytidin (5-Aza) exponiert. Zellen in P2 und P3 werden mit monoklonalen Antikörpern auf die Expression myogener Marker immuncytochemisch untersucht. Glattmuskuläres alpha-Aktin (Klon 1A4) ist in 50-90 % und alpha/gamma-Aktin (Klon CGA7) in 20 % der Zellen exprimiert. Der Nachweis skelettmuskulärer Marker ergibt mit einem Antikörper gegen MyoD (Klon MoAb5.8A) eine Reaktion in einzelnen Zellen. Die Expression von Myosin (Klon NOQ 7.5.4D) kann nicht nachgewiesen werden. Somit werden mMSZ bei einer Exposition gegenüber 5-Aza in vitro insbesondere in glattmuskuläre Zellen differenziert. Die Kontrollen zeigen eine vergleichbare Expression der myogenen Marker. Für den Nachweis in vivo werden die zur myogenen Differenzierung behandelten mMSZ mit dem Vitalfarbstoff PKH 26 markiert und direkt in den Blasenhals der Versuchstiere gespritzt. Die Integration wird nach 2, 58, 65, 135 und 163 Tagen hitologisch und immunhistochemisch mit den gleichen Antikörpern wie in der Immuncytochemie untersucht. Die transplantierten Zellen kann für jeden Versuchszeitpunkt nachgewiesen werden. In einzelnen Tieren kann nach 58 Tagen auch eine gleichmäßige Verteilung im Blasenhalsgewebe festgestellt werden. In den Gewebeschnitten von drei Ratten kann ein glattmuskulärer Phänotyp den injizierten Zellen zugeordnet werden. Entzündungsreaktionen und Tumorbildungen werden nicht beobachtet. Nach Isolierung von hMSZ aus dem Knochenmark durch Plastikadhärenz werden konfluente Kulturen in P1 für 24 Stunden mit 5-Aza differenziert. Die Expression von glattmuskulärem alpha-Aktin und alpha/gamma-Aktin sowie skelettmuskulärem MyoD und Myosin wird immuncytochemisch in P2 bis P6 und in unbehandelten Kontrollen in P0 bis P6 untersucht. Für den Nachweis der direkt in den Blasenhals immundefizienter Nacktratten injizierten hMSZ werden diese direkt vor der Applikation ebenfalls mit PKH 26 markiert. Die Integration in das Zielgewebe wird nach 56 Tagen und bei den Kontrollen mit nativen hMSZ auch nach 4, 8, 12 und 28 Tagen histologisch überprüft und die integrierten hMSZ immunologisch charakterisiert. Die Histologie zeigt gut abgrenzbare Gruppen transplantierter Zellen in den Geweben des Blasenhalses über den gesamten Versuchszeitraum. Entzündungsreaktionen und tumoröse Entartungen werden nicht nachgewiesen. Glattmuskuläres alpha-Aktin und alpha/gamma-Aktin sowie skelettmuskuläres MyoD werden in nicht gegenüber 5-Aza exponierten MSZ in P0 in 62 %, 60 % bzw. 73 % und in P1 in 94 %, 100 % bzw. 92 % nachgewiesen; in P2 bis P6 ist nur noch alpha-Aktin exprimiert (65-84 %). Hingegen zeigen gegenüber 5-Aza exponierte hMSZ für diese Marker einheitliche Expressionsmuster in P2 bis P6 mit einem Nachweis von alpha-Aktin in 86-97 %, alpha/gamma-Aktin in 81-100 % und MyoD in 63-100 % der Zellen. Skelettmuskuläres Myosin ist in beiden Gruppen nicht nachweisbar. In der Immunhistochemie der Präparate können muskuläre Antigene nicht eindeutig nachgewiesen werden. Die Untersuchungen zur Differenzierung von hMSZ aus dem Knochenmark in glatte- und Skelettmuskelzellen zeigen, dass eine Exposition gegenüber 5-Aza nicht notwendig ist. Allerdings ist sie für eine dauerhafte Expression in vitro erforderlich. Die Tiermodelle unterstreichen die Verwendung autologer MSZ für die Behandlung der Belastungsinkontinenz beim Menschen und ebenso auch beim Tier. In weiteren Studien werden die myogene Differenzierung in vivo und die Integration in den Rhabdosphinkter in einem xenogenen Großtiermodell genauer erforscht wobei auch Untersuchungen zur Verbesserung der Sphinkterfunktion durchgeführt werden.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2009