Die Rolle des VEGF-Rezeptor-1 bei der Hypoxie-induzierten Hyperpermeabilität

Abstract

Ziel dieser Dissertationsarbeit war es, die Mechanismen der Signaltransduktion der Hypoxie-induzierten Hyperpermeabilität durch VEGF zu erforschen. Speziell die Frage, welcher der VEGF-Rezeptoren für die Signalvermittlung verantwortlich ist, sollte dabei untersucht werden.Am in vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke, bestehend aus porcinen mikrovaskulären Gehirnendothelzellen (BMEC) konnte gezeigt werden, dass die Hypoxie- und VEGF-induzierte Hyperpermeabilität durch Aktivierung von Flt-1 vermittelt wird. So erhöhte die Zugabe von PlGF, das lediglich Flt-1 und nicht Flk-1 bindet, die Permeabilität in gleicher Weise wie VEGF, wohingegen VEGF-E, ein virales VEGF-Homolog, das Flk-1 und Neuropilin-1, aber nicht Flt-1 aktiviert, keine Effekte auf die Permeabilität der Endothelzellen hatte. Darüber hinaus konnte durch AS-Oligonukleotide gegen Flt-1, aber nicht gegen Flk-1, die Hypoxie-induzierte Hyperpermeabilität der BMEC aufgehoben werden.Da Endothelzellen beide VEGF-Rezeptoren exprimieren und die Verwendung von spezifischen Liganden oder Inhibitoren der Rezeptoren eine mögliche intermolekulare Aktivierung nicht auszuschließen vermag, sollten die Untersuchungen zusätzlich an einer Zelle durchgeführt werden, die nur Flt-1 exprimiert. Die Zellen sollten dabei in Form eines Monolayers wachsen und dabei dichte Tight Junctions ausbilden, die eine Permeabilitätsbarriere darstellen.Neben Endothelzellen werden die VEGF-Rezeptoren auch auf verschiedenen Epithelzellen exprimiert, die ebenfalls durch Tight Junctions miteinander verbunden sind und deren Monolayer hoher Widerstandswerte aufweisen. Mittels RT-PCR und Northern Blot-Analyse sowie Western Blot und Immunzytochemie wurden verschiedene Epithelzellen hinsichtlich ihrer Expression von Flt-1 und Flk-1 untersucht. Die primären CPE-Zellen zeigten dabei eine Expression beider Rezeptoren, MDCK exprimierten keinen der Rezeptoren. Die epitheliale Tumorzelllinie CSG zeigte lediglich die Expression von Flt-1. Durch Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes konnte bei allen Epithelarten eine gute Ausbildung von Tight Junctions bestimmt werden.Permeabilitätsstudien unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen in An- und Abwesenheit eines neutralisierenden Antikörpers gegen VEGF sowie unter Zugabe von VEGF und PlGF zeigten, dass die Hypoxie-induzierte Hyperpermeabilität über VEGF durch Flt-1 in Abwesenheit von Flk-1 vermittelt werden kann. Die Ergebnisse konnten durch Versuche an den CSG-Zellen mit AS-Oligonukleotiden gegen Flt-1 und Flk-1 bestätigt werden.Weitere Permeabilitätsstudien unter Verwendung spezifischer Inhibitoren der Signalkaskaden sowie Western Blot Analysen zeigten dann, dass die Hyperpermeabilität über eine Aktivierung des PI3-K/Akt→NOS→sGC-Signalweges zustande kommt. PLC, PKC sowie p38 und p42/44 MAPK waren an den Veränderungen der Permeabilität nicht beteiligt. Da über den PI3-K/Akt-Signalweg auch proliferative und anti-apoptotische Reize vermittelt werden können, wurden Proliferationstests an den CSG-Zellen unter Zugabe von VEGF und PlGF-1 durchgeführt. Durch die Ergebnisse aus der Messung der [³H]-Thymidin-Inkorporation und einer kolorimetrischen Bestimmung konnte dann abgeleitet werden, dass die Aktivierung von Flt-1 in Abwesenheit von Flk-1 keine Proliferation der CSG-Zellen bewirkt, wohl aber zu einer Steigerung des Metabolismus der Zellen mit der Folge der vermehrten Bereitstellung der Energieträger NADH/H+ und NADPH/H+ führen kann.Die Erkenntnisse dieser Dissertationsarbeit könnten hilfreich sein in der Entwicklung von Therapiestrategien bei der Behandlung des durch VEGF vermittelten Hypoxie- oder Tumor-bedingten vasogenen Hirnödems. Auch in der onkologischen Therapie kann davon profitiert werden, da bekannt ist, dass viele Tumore VEGF sowie die VEGF-Rezeptoren exprimieren und eine Aktivierung durch VEGF zu Tumorwachstum und Metastasierung führen kann. The present dissertation studies the mechanism of signaltransduction for hypoxia-induced hyperpermeability via VEGF. In particular, it will be analyzed which of the VEGF-receptors is responsible for signal transmission.An in vitro blood-brain barrier model consisting of porcine brain microvascular endothelial cells (BMEC) was used to show that Hypoxia- and VEGF-induced hyperpermeability is mediated by activation of Flt-1. Addition of the receptor-specific homolog placental growth factor, which binds Flt-1 but not Flk-1, increased endothelial permeability to the same extent as VEGF, whereas adding VEGF-E, a viral VEGF molecule from the orf virus family activating Flk-1 and neuropilin-1, but not Flt-1, did not show any effect. Furthermore, selective antisense oligonucleotides against Flt-1, but not Flk-1, inhibited hypoxia-induced permeability changes.Since endothelial cells express both VEGF-receptors and due to the fact that using specific ligands or inhibitors of the receptors does not preclude an intermolecular crosstalk and activation of the receptors, it was necessary to perform these studies using cells, wich only express Flt-1. Furthermore, these cells have to form tight monolayers by connecting tight junctons between single cells, thus forming a permeability barrier. Besides endothelial cells, epithelial cells also express VEGF-receptors. Both epithelial and endothelial cells are connected through Tight Junctions whose tightness can be controlled in a comparable way.Using RT-PCR, northern blot, western blot and immuncytochemistry analysis the expression of VEGF-receptors Flt-1 and Flk-1 was tested in several epithelial cells. It turns out that primary CPE cells express both receptors, while MDCK expresses none of them. The epithelial tumor cell line CSG only expresses Flt-1.Further permeability studies under normoxic and hypoxic conditions, using the CSG only expressing Flt-1 in the absence and presence of neutralizing antibodies against VEGF as well as under a high concentration of VEGF and PIGF demonstrated that Flt-1 is sufficient to induce hyperpermeability by hypoxia and VEGF independently on the presence of Flk-1. Moreover, it was demonstrated, that hyperpermeability, induced by hypoxia/VEGF, depends on activation of phosphatidylinositol 3-kinase/Akt (PI3-K/Akt), nitric oxide synthase (NOS) or protein kinase G (PKG). Neither PLC, PKC, nor MAPK p38 or p42/44 were involved in those permeability changes. Because the PI3-K/Akt pathway also transmits proliferative and anti-apoptotic stimuli, further proliferation studies with the CSG cells, adding VEGF and PIGF-1, were performed. Testing the [³H]-thymidine incorporation and by using a colorimetric, non-radioactive assay, no cell-proliferation was measured, but increased levels of NADH/H+ and NADPH/H+ could be an indication of increased cell viability after activation of PI3-K/Akt by VEGF, mediated by Flt-1.These results will be helpful to develop therapeutical strategies to prevent hypoxia/VEGF-induced hyperpermeability leading to vasogenic brain edema formation, without interfering with the beneficial angiogenic and neuroprotective effects of VEGF. Moreover, the findings of this research could be used when treating cancer, since it is well known that many tumors express VEGF or VEGF-receptors and that activation due to VEGF can cause growth of the tumor and its dissemination.