Generierung von K-Ras(G12C)-Inhibitor-resistenten Lungen- und Pankreaskarzinomzellen zur Charakterisierung von Signalwegen, die eine adaptive Resistenz gegen K-Ras(G12C)- Inhibitoren vermitteln

Abstract

Mit der Entwicklung der K-Ras(G12C)-spezifischen Inhibitoren AMG510 und MRTX849 ist es gelungen, die Zielstruktur des mutierten K-Ras zu inhibieren. Dies stellt eine vielversprechende Strategie zur Behandlung mit mutierten K-Ras Proteinen Tumoren dar. Allerdings zeigte sich bislang nur ein temporärer therapeutischer Effekt, da es zu Resistenzbildung im Verlauf der Behandlung kommt und somit die langfristige Wirksamkeit der Therapie limitiert wird. Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war die Generierung von AMG510- und MRTX849-resistenten Zellklone der Lungenkarzinom-Zelllinie H358 und der Pankreaskarzinom-zelllinie MiaPaCa-2 mittels der Anwendung der „increasing drug dose method“. Zur Untersuchung möglicher Resistenzmechanismen wurden im Prozess der Resistenzentwicklung eine Charakterisierung der Proliferation mittels der Dokumentation der Änderungen der Proliferationszeiten, der Zellzahl und der Verdopplungszeit durchgeführt. Zusätzlich wurde auf der Grundlage von Western Blot-Analysen Veränderungen in der Phosphorylierung zentraler Signalproteine der Ras/Raf/MEK/ERK- und PI3-Kinase/AKT1/2/mTORC1/S6K-Signalwege untersucht. Darüber hinaus erfolgte eine Dokumentation der Veränderungen der Zellmorphologie während der Generierung mittels Fotodokumentation und Immunfluoreszenzanalysen. Die Daten unserer Untersuchung zeigen, dass die Resistenzentwicklung in den MiaPaCa-2-Zellklone zu einer anhaltend erhöhten Phosphorylierung von ERK1/2, AKT1/2 und S6 führt, wobei sich als mögliche Ursache eine erhöhte Aktivität von Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs) andeutet. Die Resistenzentwicklung der H358-Zellklone zeigte ein heterogenes Phosphorylierungsmuster der zentralen Signalproteine mit einer möglichen Beteiligung von RTKs. Die beobachteten morphologischen Veränderungen korrelieren mit epithelial-mesenchymalen Transition (EMT)-assozierten Prozessen. Nach dem Absetzen des Inhibitors AMG510 in den resistenten MiaPaCa-2-Zellklonen zeigte sich eine reduzierte Aktivität der Signalwege, eine morphologische Veränderung hin zum ursprünglichen Phänotyp und die Proliferation stieg erneut an. Diese Befunde deutet darauf hin, dass die Resistenz in den MiaPaCa-2-Zellklonen auf adaptive, reversible Mechanismen basiert und nicht durch irreversible Veränderungen verursacht wird. Die Reversibilität der Resistenzmechanismen legt nahe, dass gezielte Therapiepausen eine potenzielle Strategie zur Überwindung der Resistenzmechanismen darstellen könnten.