Einfluss von oxidiertem LDL und Lysophosphatidylcholin auf den Ca2+-aktivierten K+-Kanal mit großer Leitfähigkeit und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Proliferation, NO- und Ca2+-Homöostase humaner Endothelzellen

Abstract

In der vorliegende Arbeit wurde der Einfluss von oxidiertem LDL (oxLDL) und dessen Hauptbestandteil Lysophosphatidylcholin (LPC) auf den Ca2+-aktivierten K+ Kanal mit großer Leitfähigkeit (BKCa), die intrazelluläre Ca2+ Konzentration ([Ca2+]i) und Acetylcholin-induzierte NO-Bildung in humanen Endothelzellen aus Umbilikalvenen (HUVEC) untersucht. Mit Hilfe der Patch-Clamp Technik konnte gezeigt werden, dass oxLDL und LPC eine signifikante Erhöhung der Öffnungswahrscheinlichkeit des BKCa bewirken. Dieser Effekt wurde über den endothelialen Oberflächenrezeptor für oxLDL LOX-1 vermittelt. Mit Hilfe des Fura-2-Imaging wurden Veränderungen der [Ca2+]i gemessen. Sowohl oxLDL als auch LPC bewirkten einen biphasischen Anstieg der [Ca2+]i. Die frühe, steil ansteigende Komponente konnte durch Vorinkubation mit dem selektiven BKCa Inhibitor IBX signifikant reduziert werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich die folgende Hypothese aufstellen: oxLDL und LPC bewirken eine Erhöhung der [Ca2+]i, was eine Aktivierung des BKCa zur Folge hat. Diese Steigerung der Ionenkanalaktivität bewirkt eine Hyperpolarisation der endothelialen Zellmembran, so dass extrazelluläres Ca2+ transmembranär in die Zelle einströmen kann. Diese Erhöhung der [Ca2+]i bewirkt eine weitere Verstärkung der BKCa-Aktivität. Durch Zellzählung und Messung der [3H]-Thymidin Inkorporation wurde der Einfluss von oxLDL/LPC auf das endotheliale Proliferationsverhalten untersucht. Beide Substanzen bewirkten eine signifikante Steigerung der Proliferation. Dieser Effekt ließ sich durch gleichzeitige Gabe von IBX signifikant reduzieren. Die Ach-induzierte NO-Synthese wurde mit einem cGMP-Radioimmuno-assay (cGMP-RIA) analysiert. In vorausgegangenen Patch-Clamp Messungen konnte eine signifikante Steigerung der BKCa Aktivität durch Ach in HUVEC nachgewiesen werden. In den cGMP-RIAs bewirkte eine Blockade des BKCa mit IBX eine signifikante Reduktion der Ach-induzierten cGMP-Spiegel. Eine Reduktion der cGMP-Spiegel wurde ebenfalls durch oxLDL/LPC bewirkt, obwohl beide Substanzen den BKCa aktivieren. Dieser Effekt konnte auf eine vermehrte Radikalbildung durch die NAD(P)H-oxidae zurückgeführt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit verdeutlichen, dass oxLDL und LPC die Aktivität des BKCa in HUVEC steigern. Die oxLDL/LPC-induzierte Aktivierung des BKCa beeinflusst endotheliale Zellfunktionen (NO-Produktion, Proliferation), welche ihrerseits wichtige Bestandteile in der Pathophysiologie der Arteriosklerose sind. Aim of this study was to analyse the effect of oxLDL and its major component lyophosphatidylcholine (LPC) on endothelial Ca2+-activated K+ channels (BKCa) and its contribution to oxLDL/LPC-mediated changes of proliferaton and production of NO. The patch-clamp technique was used to study the behavior of BKCa in human endothelial cells of umbilical cord veins (HUVEC). OxLDL/LPC caused a significant increase of BKCa activity, whereas preincubation of HUVEC with an antibody against the endothelial oxLDL-receptor LOX-1 abolished BKCa activation. Changes of intracellular Ca2+ centration ([Ca2+])i were measured by means of Fura-2 imaging. A biphasic increase of intracellular Ca2+ after application of oxLDL/LPC was observed. The early component of this Ca2+ increase was blocked by the BKCa inhibitor iberiotoxin (IBX). These results can be summarized in the following hypothesis: oxLDL/LPC cause an increase of ([Ca2+])i resulting in an activation of BKCa. Increased BKCa activity causes a membrane hyperpolarization. This hyperpolarization is followed by a transmembrane Ca2+ entry, further increaing BKCa-activity. Cell counts and [3H]-thymidine-incorporation were used to analyse proliferation. Endothelial proliferation was significantly increased by oxLDL/LPC. IBX blocked this proliferative response. Synthesis of NO was measured by means of 3[H]-cGMP-radioimmunoassay. Acetylcholine-induced NO synthesis was significantly decreased by IBX. Interestingly, oxLDL/LPC significantly decreased acetylcholine-induced NO synthesis if the production of superoxide was not blocked by antisense oligonucleotides against the NAD(P)H-oxidase. The presented data demonstrate that oxLDL/LPC activate BKCa, which plays an important role in oxLDL/LPC-mediated endothelial proliferation. Acetylcholine-induced NO synthesis is modulated by BKCa, whereas the reduction of acetylcholine-induced NO-synthesis by oxLDL/LPC is related to an increase in superoxide production. This study shows a new mechanism in the pathophysiology of atherosclerosis.