Der cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ist ein Cl -leitender Ionenkanal in der apikalen Membran verschiedener Epithelien des menschlichen Körpers. Eine Vielzahl von CFTR-exprimierenden Geweben, wie z.B. Lunge, Darm, sind dauerhaft in Bewegung und somit mechanischen Kräften, wie Scherkraft (SK) und Dehnung ausgesetzt. In der Lunge resultieren aus den Atembewegungen mechanischen Kräfte. Es gibt erste Hinweise darauf, dass die Aktivität des CFTR durch mechanische Stimuli reguliert werden kann. Darüber hinaus ist aus Studien anderer mechanosensitiver Ionenkanäle bekannt, dass sowohl die Membranzusammensetzung als auch die Verbindungen mit dem Zytoskelett an der Wahrnehmung und Weiterleitung mechanischer Kräfte beteiligt sein können. Basierend auf diesen Hinweisen waren die Ziele der vorliegenden Arbeit: 1) die Untersuchung von SK und/oder Dehnung als adäquater mechanischer Stimulus der Regulation der CFTR-Aktivität, 2) die Verifizierung der mechanosensitiven CFTR-Aktivierung in einem nativen Epithel sowie 3) die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen einer mechanosensitiven CFTR-Aktivierung.Ziel 1) Der humane CFTR (hCFTR) wurde heterolog in Oozyten des Afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis exprimiert und die Aktivität des hCFTR wurde durch Forskolin und IBMX (F/I) induziert und mittels der two-electrode voltage-clamp (TEVC)-Technik bestimmt. Es wurde kein Einfluss von SK, in einer physiologisch relevanten Größenordnung (1,3 dyn/cm2), auf die Aktivität des hCFTR nachgewiesen. Über die Erhöhung des Oozytenvolumens durch osmotische Zellschwellung oder durch Injektion einer intrazellulär-analogen Lösung erfolgte die Membrandehnung, wodurch sich die F/I-induzierte hCFTR-Aktivierung erhöhte. Wurde der hCFTR mit F/I vorstimuliert, erhöhte sich die hCFTR-Aktivität unmittelbar durch den Dehnungsstimulus. Dieser Effekt konnte durch den hCFTR Blocker CFTRinh-172 inhibiert werden. Die Dehnungs-induzierte Aktivierung konnte zudem auch bei den zwei häufigen CFTR-Mutationen, delF508 und G551D, nachgewiesen werden und war unverändert im Vergleich zum Wildtyp hCFTR.Ziel 2) Um die Dehnungs-sensitive CFTR-Aktivität in einem nativen pulmonalen Epithel zu untersuchen, wurden Ussing-Kammer-Experimente mit Lungenpräparaten von Xenopus durchgeführt. Die Dehnung des Epithels wurde durch eine Erhöhung des hydrostatischen Drucks (HD; 5 cm und 10 cm Flüssigkeitssäule) induziert. Unter Kontrollbedingungen resultierte die Applikation von HD in einem Stromabfall und in einer Aktivierung der Cl -Sekretion. In Anwesenheit des CFTR-Inhibitors GlyH-101 war der HD-induzierte Stromabfall vergrößert, was die Dehnungs-sensitive Aktivierung des CFTR unter Kontrollbedingungen bestätigt.Ziel 3) Um zu überprüfen, ob die Membranfluidität an der Mechanosensitivität des hCFTR beteiligt ist, wurde die Membranfluidität von hCFTR-exprimierenden Oozyten pharmakologisch erhöht oder reduziert. Die Dehnungs-induzierte hCFTR-Aktivität war sowohl bei erhöhter als auch reduzierter Membranfluidität verringert im Vergleich zu unbehandelten Oozyten. Zur Überprüfung einer möglichen Beteiligung von Zytoskelettelementen an der Dehnungs-wahrnehmung des hCFTR wurden Aktinfilamente und Mikrotubuli pharmakologisch destabilisiert und stabilisiert. Während die Destabilisierung der Aktinfilamente sowie der Mikrotubuli keine Änderung der Dehnungs-induzierten hCFTR-Aktivität zur Folge hatte, führte die Stabilisierung beider Zytoskelettelemente zu einer verringerten Dehnungswahrnehmung des hCFTR. Mittels zielgerichteter Mutagenese wurden drei C-terminale Aminosäuren (TRL) des hCFTR deletiert, da diese einen Verknüpfungspunkt zum Zytoskelett darstellen. Die Dehnungswahrnehmung dieser delTRL hCFTR-Mutante war signifikant vermindert im Vergleich zum Wildtyp hCFTR. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Dehnung sowohl im in vitro System der Xenopus Oozyten als auch in einem nativen Lungenepithel der adäquate mechanische Stimulus für die Regulierung der CFTR-Aktivität ist. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse zum ersten Mal, dass die Membranfluidität, ein intaktes Zytoskelett und die Aktin-Bindestelle am C-Terminus des hCFTR notwendig für die Wahrnehmung des Dehnungsstimulus des hCFTR sind.
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