Modell und Berechnung von Konzentrations-Inhibitionskurven hoch- und niedrigpotenter Substanzen am TTX-resistenten Natriumkanal der erwachsenen Ratte

Abstract

Natriumkanal-blockierende Substanzen haben einen hohen Stellenwert in der Therapie pathologischer Zustände, die mit einer Hyperexcitabilität elektrisch erregbarer Zellen einhergehen wie cerebrale Krampfanfälle, kardiale Arrhythmien oder neuropathische Schmerzsyndrome. Die Interaktion Natriumkanal-blockierender Pharmaka mit dem Natriumkanal ist komplex, da der Natriumkanal in Abhängigkeit seines Erregungszustandes verschiedene Zustandsformen annehmen kann, die unterschiedliche Affinitäten zum Blockermolekül besitzen. Die Konzentrations-Inhibitionskurven der meisten Natriumkanalblocker weisen einen Hill-Faktor von eins auf, was zu der Annahme führt, dass ein Blockermolekül einen Natriumkanal blockiert. Bei sehr niedrig potenten Blockern ist die Steilheit (Hill-Faktor) der Kurve oft größer; die Ursache hierfür ist unklar.Ziel dieser Arbeit war es, anhand bekannter Konzentrations-Inhibitionskurven durch nichtlineare Kurvenanpassung verschiedener Modelle herauszufinden, welcher molekulare Mechanismus für die steilere Konzentrations-Inhibitionskurve bei der Natriumkanalblockade von Bedeutung ist. Als Grundlage der Arbeit dienten Konzentrations-Inhibitionskurven verschiedener Natriumkanal-blockierender Substanzen aus eigenen und aus Untersuchungen anderer Autoren, die mithilfe der whole-cell patch clamp -Technik an TTX-resistenten Natriumströmen in Spinalganglienzellen der Ratte gewonnen wurden.Die Kurven wurden mit vier verschiedenen Gleichungen angepasst, denen unterschiedliche Blockierungsmodelle zugrunde liegen. Dies sind: A: Hill Gleichung mit Hill-Faktor eins. B: Wie A mit freiem Hill-Faktor, C: Mehrere Blockermoleküle blockieren den Kanal, wobei alle Moleküle gebunden sein müssen, D: Wie C, wobei die Bindung eines Moleküls ausreicht um den Kanal zu blockieren.Untersucht wurden die Konzentrations-Inhibitionskurven von 21 Substanzen. Bei 11 Substanzen zeigte sich bei der Anpassung mit der Hill-Gleichung (B) eine Steigung um eins, bei 10 Substanzen war die Steigung größer 1,1. Mit Gleichung D konnte bei 14 Substanzen eine bessere Anpassung erreicht werden, mit Gleichung C bei 4 Substanzen.Korreliert man die Zahl der Bindungsstellen mit der Ausprägung des use-dependent Blocks, zeigt sich, dass nur Substanzen die an einer oder wenigen Bindungsstellen wirken, einen use-dependent Block aufweisen. Die Ergebnisse zeigen, dass verschiedene Natriumkanal-blockierende Substanzen unterschiedliche Wirkmechanismen aufweisen können. Die Bindung klassischer Lokalanästhetika an den Natriumkanal lässt sich mit einer einfachen 1:1 Bindung mittlerer Affinität an die bekannte Bindungsstelle in der Natriumkanalpore erklären. Schwach potente Lokalanästhetika scheinen jedoch über mehrere unspezifische Bindungsstellen mit niedriger Affinität zu wirken wobei aufgrund der vielen Bindungsstellen die Affinität höher erscheint. Lokalanästhetika die über diesen Wirkmechanismus wirken, zeigen keinen use dependent Block. Das Blockierungsmodell erklärt gut die in der Literatur oft zu beobachtenden Abweichungen niedrig potenter Lokalanästhetika von der Hill-Funktion. Sodium channel blocking drugs play a decisive role in the treatment of pathologies associated with hyperexcitation of electrically excitable cells. Examples include antiarrhythmics and local anesthetics in ventricular tachycardia, anticonvulsants for seizures and all together in neuropathic and other chronic pain syndromes. The interaction of sodium channel blocking drugs with the sodium channel is rather complex, because it has various states depending on its activation state. These various states are different in their affinity to the blocker molecule. To determine the blocking potency of different drugs concentration-inhibition-curves are created and fitted with the Hill-function. The Hill-coefficient for most substances is equal to one, which equates to the reaction of one blocker molecule with one sodium channel. The slope (Hill-factor) of very low potent blockers is often larger and the reason for this is unclear. The aim of this study was to discover which molecular mechanism for the steeper concentration-inhibition curve of the sodium channel blockade is important, based on nonlinear curve fitting of known concentration-inhibition curves to various models. Concentration inhibition curves of various sodium channel-blocking agents from my own data and from data of other authors using the whole-cell patch clamp technique on TTX-resistant sodium currents in dorsal root ganglion cells of the rat were investigated. The curves were fitted with four different equations which describe different models of blocking. These are: A: Hill equation with Hill factor one. B: Same as A with free Hill factor. C: Multiple blocker molecules block the channel, wherein all of the molecules must be bound to cause blockage. D: Similar to C, but where the binding of a single molecule is sufficient to block the channel: The concentration-inhibition curves of 21 substances were investigated. For 11 compounds the fitting using the Hill equation (B) had a slope by one. 10 substances showed a slope greater than 1.1. Using equation D, 14 substances showed an improved fit, with equation C only 4 substances. Correlation of the number of binding sites with the degree of the use-dependent block shows that only substances acting with one or few binding sites present a use-dependent block.The results show that different sodium channel-blocking agents may have different mechanisms of action. The binding of local anesthetics to the classical sodium channel can be explained by a simple 1:1 binding with medium affinity to the well-known binding site in the sodium channel pore. Low potent local anesthetics interact with several non-specific binding sites with low affinity but with an overall much higher appearing affinity of the channel block. Local anesthetics acting via this mechanism of action show no use dependent block. This model of blocking can explain the in literature often observed deviations of low potent local anesthetics from the Hill function