Affordable diagnosis for Chagas disease

Abstract

Chagas disease, caused by the flagellate Trypanosoma cruzi, is endemic in Latin America where it imposes a high burden on disability and death combined with enormous economic losses for up to 18 million people. Useful tests for the diagnosis of the disease are available, but they are too expensive to be used in in large scale in most of the affected countries. Furthermore, many diagnostic kits cannot clearly discriminate between Chagas disease and visceral leishmaniasis, which can be tolerated for immunological screening of samples in blood banks, but not for patients, since both diseases can occur in the same areas, however, need to be treated with different drugs. In addition, it is essential to recognise infection with T. cruzi in time, i.e. before the onset of severe clinical symptoms, since the available drugs are effective in the early stages of the disease only. This demands developing more specific and less expensive diagnostic tools. By means a bioinformatic approach, several recombinant antigens were produced, predominantly consisting of tandemly repeated amino acid sequences which occur in large numbers in different proteins of the parasite. Since the corresponding repeated DNA structures could not be maintained stably in E. coli, the whole range of possible base variations in codons was used to create varying coding sequences for up to nine tandem repeats of identical amino acid sequences. Some but not all of the expressed proteins were found to react strongly with sera from infected patients. To simplify purification as well as production, the most suitable antigens were fused. At the end a product composed of four different tandem repeat motives was obtained revealing an unexpected high diagnostic sensitivity, which was several orders of magnitude higher than with the antigens known so far. When used in ELISA, one milligram of the recombinant antigen is sufficient for one million single tests. Immunoassays can frequently not discriminate between acute infection and overcome disease. Therefore, two different PCR assays were developed in addition to determine the number of parasites circulating in blood after therapy with drugs. Targets of the one PCR assay are the more than 200 fold amplified genes for 18S rRNA and, for the other assay, the kinetoplast minicircle DNA which occurs in approximately 10.000 copies per parasite. Both of these test can detect as few as 10 trypanosomes per millilitre of blood and can clearly discriminate T. cruzi infections from infections with other Trypanosomatides. In conclusion, several highly sensitive and specific diagnostic procedures have been created, which are relatively simple to be performed and which can be produced for a low price. It is the goal to instruct scientist in Latin America to produce and to use these tests in the long term by their own means, independent of support from abroad. Die Chagas-Krankheit wird durch den Flagellaten Trypanosoma cruzi ausgelöst und ist in Lateinamerika endemisch. Sie betrifft dort bis zu 18 Millionen Menschen und führt in vielen Fällen zu schweren gesundheitlichen Schäden, nicht selten mit tödlichem Verlauf. Es gibt empfindliche diagnostische Nachweisverfahren für die Krankheit, aber sie sind entschieden zu teuer um in den betroffenen Ländern zum Einsatz zu kommen. Außerdem können viele dieser Verfahren nicht zwischen der Chagas-Krankheit und viszeraler Leishmaniose unterscheiden. Das kann bei der Untersuchung von Proben in Blutbanken zwar toleriert werden, ist aber für die Diagnose von Patienten inakzeptabel, da beide Krankheiten in derselben Region auftreten können, jedoch mit unterschiedlichen Medikamente behandelt werden müssen. Darüber hinaus ist es wichtig, Infektionen mit T. cruzi rechtzeitig zu erkennen, lange bevor schwere Symptome auftreten, denn die verfügbaren Medikamente sind nur in der früheren Phase der Krankheit wirksam. Dies erfordert die Entwicklung neuer diagnostischer Methoden mit höherer Spezifität und niedrigeren Kosten. Im Rahmen der Arbeit wurden mittels bioinformatischer Methoden mehrere rekombinante Antigene hergestellt, die hauptsächlich aus Wiederholungen von Aminosäuresequenzen bestehen und in großen Zahl in verschiedenen Proteinen der Parasiten vorkommen. Weil die entsprechenden repetitiven DNA Segmente nicht stabil in E. coli etabliert werden konnten, wurden Gene mit möglichst vielen Austauschen in variablen Codons hergestellt. Auf diese Weise gelang es, codierende Bereiche für bis zu neun identische Aminosäurensequenz-Wiederholungen stabil in E. coli zu etablieren. Manche der gereinigten Proteine reagierten stark mit Seren von infizierten Patienten. Um Produktion und Reinigung zu vereinfachen, wurden die am stärksten reaktiven Antigene fusioniert. Am Ende entstand ein Antigen mit vier unterschiedlichen repetitiven Motiven, das in verschiedenen immunologischen Tests zu einer extrem starken Reaktivität mit Patientenseren führte. Ein Milligram dieses rekombinanten Proteins ist ausreichend um eine Million Einzelversuche im ELISA durchzuführen. Immundiagnose kann im Allgemeinen oft nicht zwischen akuter und überstandener Infektion unterscheiden. Dies ist aber wichtig um den Erfolg einer medikamentösen Behandlung verfolgen zu können. Daher wurden zusätzlich zwei verschiedene PCR-Nachweisverfahren für die Krankheit entwickelt. Mit der einen PCR werden die Gene der 18S rRNA amplifiziert, die in mehr als 200 Kopien im Genom von T. cruzi vorliegen, die andere PCR ist spezifisch für die mitochondriale Minicircle-DNA, die etwa 10.000fach im Parasiten vorliegt. Beide Tests haben eine Nachweisempfindlichkeit von ca. 10 Parasiten pro Milliliter Blut und können klar zwischen Infektionen mit den verschiedenen anderen auftretenden Trypanosomatiden unterscheiden. Insgesamt wurden in Rahmen dieser Arbeit mehrere äußerst empfindliche und spezifische Diagnoseverfahren für die Chagas-Krankheit entwickelt. Sie können alle mit relativ geringem Aufwand durchgeführt und mit niedrigen Kosten hergestellt werden. Das weitere Ziel wird sein, Wissenschaftler in Lateinamerika anzuleiten, diese Diagnoseverfahren nicht nur zur Anwendung zu bringen, sondern sie auch in Eigenregie, d.h. ohne Hilfe von außen herzustellen.