Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin festzustellen, ob über eine Synchronisierung des Zellzyklus eine gerichtete Insertion vonFremd-DNS-Sequenzen in ein Empfängergenom (hier Daucus carota) mithilfe von Agrobacterium tumefaciens nachweisbar ist. Da eineInsertion auch außerhalb der DNS-Synthese-Phase vorstellbar ist, sollte der Einfluß verschiedener Transformationszeitpunkte im Verlaufdes Zellzyklus (in Stunden nach dessen erneuter Anregung mit Thymidin angegeben) auf den Einbau der Fremd-DNS geklärt werden.Durch die Verwendung eines Plasmid-Konstrukts unter der Kontrolle der eigenen Promotoren, das eine Kombination von rol-Genen(rolABC) beinhaltete, sollte ein morphologischer Marker geschaffen werden, der eine frühe visuelle Selektion und Bonitur der durch dieTransformation bedingten Veränderungen der Phytomorphologie erlaubte.
Zur Durchführung der Versuche wurde der Zellzyklus der verwendeten Karottenzellsuspensionen (in B5-Medium mit2,4-Dichlorphenoxyessigsäure kultiviert) mithilfe von 2´-Fluoro-Desoxi-Uridin und 2´-Desoxi-Thymidin-Zugabe synchronisiert. Der Erfolg derSynchronisation wurde über eine Bisbenzimid-Färbung mit anschließender cytophotometrischer DNS-Messung ermittelt. Das PlasmidpPCV 002 mit der rol-Gen-Kombination ABC wurde in Agrobacterium tumefaciens inseriert. Zur Übertragung der Fremdgene in dasKarottengenom wurden die Agrobakterien mit der Daucus carota-Suspension cokultiviert, insgesamt zu 8 verschiedenen Zeitpunkten nachInitiierung der S-Phase des Zellzyklus. Als Cokulturzeiten wurden 4, 8 und 48 Stunden verwendet. Nach Gewinnung von transgenenKarottenpflanzen über die somatische Embryogenese wurde deren DNS nach den üblichen Präparationsmethoden (Extraktions-Kit)aufbereitet, die Insertion der Fremdgene wurde anhand von PCR und Southern Blot bestimmt.
Die Synchronisierung des Zellzyklus erreichte im Durchschnitt eine Rate von ca. 60% der Zellen. Bereits schon recht früh konnten abhängigvon der Dauer der Cokulturzeit Unterschiede in der Embryonalentwicklung festgestellt werden. Die Bonitur der transgenen Pflanzen erfolgtenach einem morphologischen Bonitierungs-Schema, in dem sechs sog. 'Morphotypen' unterschieden wurden. Eine eindeutige Abstufungdes Auftretens bestimmter Morphotypen zu definierten Transformationszeitpunkten oder abhängig von der Cokulturdauer konnte nichtgegeben werden. Die Durchführung von molekularbiologischen Methoden zum Nachweis der Insertion der rol-Gene in das Pflanzengenom(PCR) ergab, daß die ursprüngliche rol-Gen-Kombination rolABC nicht in jeder transgenen Pflanzen in toto nachweisbar war. Häufigkonnten nur einzelne rol-Gene oder Zweier-Kombinationen nachgewiesen werden. Bei der Betrachtung der durchgeführten Southern Blotskonnte nur eine tendenzielle Aussage gemacht werden. Es war zu beobachten, daß die meisten auftretenden Banden nicht den erwartetenRestriktionsfragmenten eines bestimmten Molekulargewichtsbereiches entsprachen. Deshalb wurde angenommen, daß dieseVeränderungen auf Methylierung und interne Umstrukturierungen der rol-Gen-Sequenzen zurückzuführen sind.
Abschließend kann davon ausgegangen werden, daß eine gezielte Einflußnahme auf die gerichtete Insertion von Fremd-DNS durch eineZellzyklussynchronisierung nicht in vollem Maße möglich ist. Es muß jedoch über die Zellzyklussynchronisierung und die variableCokulturdauer eine gewisse Steuerungsfunktion vorhanden sein, die zur Ausbildung von 6, und nicht beliebig vielen, Pflanzenformen führt.Diese Hypothese wird bei der Betrachtung der Embryonalentwicklung insofern unterstützt, daß auch die Cokulturdauer bereits in diesenfrühen Entwicklungsstadien eine noch näher zu determinierende Wirkung besitzt.
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