Morphologische Analyse von caninen RPE65-/- Retinae vor und nach AAV-vermittelter Gentherapie

Abstract

Die frühkindliche Netzhautdegeneration, welche eine seltene Form von Blindheit beim Menschen darstellt, wird unter anderem durch Mutationen im RPE65 Gen ausgelöst. Sie ist durch verschiedene visuelle Einschränkungen innerhalb der ersten Lebensjahre charakterisiert. Der schwedische Briard ist ein natürlich vorkommendes Hundemodell für diese Erkrankung. Adenoassoziierte Viren (AAV) vermittelte Gentherapie führt bei diesen Hunden zur Wiederherstellung der Stäbchen- und Zapfenfunktion im behandelten Auge. Bei humanen Patienten hingegen ist der therapeutische Effekt gering. Das Ziel dieser Studie war es eine ausführliche immunohistochemische Untersuchung der caninen RPE65-/- Retina vor und nach erfolgreicher AAV vermittelter Gentherapie durchzuführen, um ein besseres Verständnis der Erkrankung zu erhalten.Es wurden die Retinae von 14 Hunden (n=21) untersucht, wobei drei Wildtyptiere und 11 betroffene Tiere verwendet wurden. Vier der betroffenen Tiere hatten zuvor eine unilaterale Injektion eines Vektors erhalten, welcher eine Kopie des humanen RPE65 Gens beinhaltet. Die Hunde wurden im Alter zwischen drei und 96 Monaten euthanasiert. Es wurden verschiedene Marker als Primärantikörper verwendet, um die unterschiedlichen Zellarten der Retina zu untersuchenIm Alter von zwei Jahren weisen die betroffenen Tiere einen einheitlichen Verlust von L/M-Zapfen über die gesamte Retina auf. Die S-Zapfen hingegen sind vorallem im zentralen superioren Retinabereich vermindert. Innerhalb beider Zapfentypen kommt es zu einer Delokalisation der Opsine. In der peripheren Retina kommt es zur Delokalisation von Bandsynapsen in die äußere nukleäre Schicht. Im weiteren Verlauf der Erkrankungen breiten sich die gefundenen Veränderungen über die gesamte Retina aus. Nach erfolgreicher Gentherapie ist eine Relokalisation der Zapfenopsine zu erkennen. Im behandelten Bereich kommt es zur Reduzierung des S-Zapfenverlust und der Delokalisation der Bandsynapsen.Bereits im frühen Stadium der Erkrankung treten somit massive Veränderungen in der Retina aus. Die Veränderungen verschlimmern sich im weiteren Verlauf der Erkrankung und können nicht alle durch die Gentherapie aufgehalten werden. Der therapeutische Effekt auf die S-Zapfen ist höher als auf die L/M-Zapfen. Beim Menschen allerdings wird die zentrale Sehschärfe durch die L/M-Zapfen bestimmt. Der einschränkte therapeutische Effekt auf die L/M-Zapfen könnte somit eine Erklärung für die unterschiedlichen Therapieerfolge bei Hund und Mensch darstellen.

Mutations in the RPE65 gene are associated with early onset severe retinal dystrophy, a rare form of blindness in humans that is characterized by severe visual impairment within the first years of life. The Swedish Briard dog is a naturally occurring animal model for this disease. Adeno-associated virus (AAV) mediated gene therapy in these dogs resulted in tremendous treatment benefits in terms of restoration of function in both, rods and cones. However, treatment benefit in humans is less pronounced. The aim of the study was to do an extensive immunohistochemical analysis of the canine RPE65-/- retina before and after successful AAV mediated gene therapy in order to obtain a better understanding of the disease. Retinae from 14 dogs (n=21) were used in this study, three unaffected and 11 affected animals. Four of the affected dogs were treated unilaterally with AAV vector carrying the human RPE65 gene. Dogs were euthanized at various ages, between three and 96 months. Different markers were used as primary antibodies to mark diverse cells in the retina.At two years of age in the affected dogs L/M-cone opsin expression was uniformly reduced over the whole retina however S-cone opsin expression loss was limited to superior central part of the retina. Opsin delocalization was observed in L/M and S cones. Delocalization of ribbon synapses to the outer nuclear layer was founded in the peripheral retina. In the further progression of the disease, these changes were determined in the entire retina. After successful gene therapy relocalization of cone opsins were discovered in both L/M and S cones. Reduction of both S cone loss and delocalization of ribbon synapses was observed in the treated area. There are remarkable changes in the retina at early stage of the disease. The changes extend with age and cannot all delayed by gene therapy. While S cones have a strong treatment effect, in contrast L/M cones seem to benefit less efficiently from gene therapy. In humans the central visual acuity is L/M cone dependent. The limited effect on L/M cones might be an explanation of the discrepancy between the canine and human gene therapy studies.