Schistosoma mansoni: Tyrosinkinase-Signalwege in den Reproduktionsorganen und Aktin-Promotoranalysen im Transgenmodell

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2008

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10092

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Der humanpathogene Parasit Schistosoma mansoni zeigt ein im Tierreich nahezu einmaliges biologisches Phänomen - die vom Männchen beeinflusste Maturation des Weibchens. Während der Paarung werden Signalkaskaden im Weibchen initiiert, die Proliferations- und Differenzierungsprozesse in den Reproduktionsorganen steuern. Um die zugrunde liegenden molekularen Prozesse besser zu verstehen, wurden in unserer Arbeitsgruppe Gene kloniert und charakterisiert, die für Signalmoleküle kodieren. Darunter befand sich die zelluläre Syk-Kinase SmTK4, die Yeast Two-Hybrid (YTH)-Analysen zur Folge über ihre Tandem-SH2-Domäne an die Src-Kinase SmTK6, sowie schwächer auch an die Src-Kinase SmTK3 binden kann. Da darüber hinaus die Transkripte der drei Kinasegene im Ovar und den Testes co-lokalisieren, wurden Interaktionen ihrer Translationsprodukte in diesen Geweben angenommen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte die vermutete Interaktion von SmTK4 und SmTK6 über Co-Immunopräzipitationsexperimente bestätigt werden. Über YTH-Analysen wurde für SmTK6 ebenfalls eine Interaktion mit SmTK3 nachgewiesen. Daher wird postuliert, dass die drei cytoplasmatischen Tyrosinkinasen SmTK3, SmTK4 und SmTK6 in Form eines Kinasekomplexes vorliegen. Weiterhin wurde über YTH-Analysen ein neues, transmembranes Mucin identifiziert, dessen C-Terminus mit der SH2-Domäne der Src-Kinase SmTK6 interagiert. Als potentielle upstream - Interaktionspartner des postulierten Kinasekomplexes wurden der in dieser Arbeit entdeckte Integrinrezeptor Smbeta-Int1 sowie die bereits bekannte Rezeptortyrosinkinase SmRTK1 gefunden. Quantitativen YTH-Analysen zu Folge konnten die drei Tyrosinkinasen SmTK3, SmTK4 und SmTK6 über ihre Protein-Interaktionsdomänen in unterschiedlicher Stärke an die jeweiligen intrazellulären C-Termini dieser Rezeptoren binden, wobei SmTK3 die stärkste Bindung an Smbeta-Int1 und SmTK6 die stärkste Bindung an SmRTK1 aufwies. Aufgrund der identifizierten Interaktionen von Smbeta-Int1 und SmRTK1 mit SmTK4, SmTK3 bzw. SmTK6 und der Co-Lokalisation ihrer Gentranskripte im Ovar und den Testes adulter S. mansoni, ist in der vorliegenden Arbeit eine multifaktorielle Signalkaskade in diesen Geweben postuliert worden. Die Kooperation von Smbeta-Int1 mit SmRTK1 und/oder dem transmembranen Mucin führt zur Aktivierung von SmTK6, an deren Regulation vermutlich auch SmTK3 beteiligt ist. Durch die aktive SmTK6 wird SmTK4 rekrutiert und aktiviert, die ihrerseits bislang noch unbekannte Effektormoleküle phosphoryliert. Als ein potentieller downstream - Bindungspartner konnte bereits das Hitzeschockprotein-Homolog Smp40 identifiziert werden. Um Hinweise auf die funktionelle Bedeutung von SmTK4 zu erhalten, wurden Inhibitor- und RNAi-Experimente durchgeführt. Mit Hilfe einer whole mount - Färbetechnik in Verbindung mit konfokaler Mikroskopie gelang der Nachweis phänotypischer Veränderungen im Ovar und den Testes adulter Schistosomen, die entweder mit dem Syk-Kinase-spezifischen Inhibitor Piceatannol oder mit SmTK4-spezifischen dsRNA-Molekülen behandelt worden waren. Mit beiden Anätzen wurden übereinstimmende Effekte auf die Spermatogenese (Ausbleiben reifer, elongierter Spermien) und die Oogenese (erhöhte Anzahl maturer Oocyten) festgestellt. In parallel durchgeführten Experimenten zur Charakterisierung eines Promotors, der möglicherweise konstitutiv aktiv ist, wurden über 3 kb der 5 -Region des Kandidatengens Aktin (SmAct1) in silico identifiziert. Bis zu 1,5 kb große Varianten der 5 -Region wurden für die Konstruktion von GFP-Reportergenvektoren verwendet und in Particle Bombardment - Experimenten zur Erzeugung transient transgener Schistosomen eingesetzt. Konfokal-mikroskopische Untersuchungen sowie molekulare Analysen über RT-PCRs zeigten, dass ein 445 bp-Fragment der SmAct1-5 -Region für die Transkriptionsinitiation in Adulten und Larven von S. mansoni ausreicht. In der 5 -Region des SmAct1-Gens wurde eine für Promotoren von Aktin-Genen charakteristische Anordnung aus TATA-, CArG- und CAAT-Boxen identifiziert, welche zwischen Invertebraten und Vertebraten funktionell konserviert zu sein scheint. Das gewebespezifische Auftreten von GFP-Signalen in Tegument, Parenchym und Muskeln von Adulten sowie in verschiedenen, aber nicht allen Geweben von Sporocysten deutet darauf hin, dass es sich bei SmAct1 entgegen der vorausgehenden Annahme nicht um ein konstitutiv exprimiertes Gen handelt.

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