Analyse und Verbesserung der spezifischen Detektion der Minusstrangsynthese des Hepatitis C Virus

Abstract

Das Ziel der WHO, die Hepatitis C als Gefahr für die Öffentlichkeit bis 2030 zu eliminieren, zeigt, dass diese Krankheit auch trotz wirksamer Medikamente noch ein globales Problem darstellt. Eine Impfung ist aktuell noch nicht vorhanden. Aufgrund dessen ist es wichtig, die molekularen Mechanismen des Hepatitis C Virus weiter zu untersuchen, obwohl es mit den DAA-Therapieregimen bereits suffiziente Therapiemöglichkeiten gibt. Die Etablierung eines spezifischen Systems zur Detektion der Minusstrangreplikation von Viren, entkoppelt von der Plusstrangsynthese und Translation, ist ein wichtiges Instrument, um die Mechanismen der Initiation der Minusstrangreplikation zu verstehen und mögliche Therapieansätze zu entwickeln. Ein solches System wurde von L. Shalamova für HCV entworfen, wies aber in den Experimenten ein Hintergrundsignal in der qPCR auf, welches die Aussagekraft einschränkte. Ziel dieser Arbeit war es den Grund für das Hintergrundsignal zu finden und entsprechende Modifikationen am Versuchsprotokoll vorzunehmen, welche das Hintergrundsignal verringern und damit die Aussagekraft verstärken. Als ein möglicher Grund für das Problem wurde die Bildung artifizieller Minusstränge durch ein Rückfalten des 3‘-Ende mit selfpriming und fortlaufender Transkription herausgestellt. Dieser Mechanismus ist sowohl für die in vitro-Transkription als auch für die RT-Reaktion denkbar. Ein weiterer möglicher Grund wurde in der Bildung von kurzen DNA-Oligonukleotiden beschrieben, die in Folge eines unvollständigen DNase Verdau entstehen und anschließend als Primer in der RT-Reaktion oder qPCR agieren könnten. Trotz unterschiedlicher Modifikationen des Versuchsprotokolls konnte das Hintergrundsignal mit diesen Modifikationen allerdings in Betrachtung der Verhältnisse von Hintergrundsignal zu Gesamtsignal nicht gesenkt werden. Die Versuchsergebnisse lassen keine belastbare Aussage zum Ursprung des Hintergrundes zu, weswegen weitere Untersuchungen in Zukunft notwendig sind, um dieses neue System zur Minusstrangdetektion abschließend zu etablieren. Die Verwendung einer SP6 Polymerase oder die Anpassung des pH-Wertes bei der Phenol/Chloroform-Aufreinigung könnten beispielhaft weitere Schritte sein, um das Hintergrundsignal zu eliminieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit bieten eine wichtige Grundlage für weitere Experimente zum Ursprung des Hintergrundsignals und der abschließenden Etablierung des neuen Minusstrangdetektionssystems, welches neben HCV auch bei vielen weiteren Viren eingesetzt werden könnte.