Entwicklung einer therapeutischen Strategie basierend auf CRISPR/Cas Genome Editing im Schweinemodell für Morbus Stargardt

Abstract

STGD1 ist eine der häufigsten genetisch bedingten Ursachen für Sehbehinderung. Verursacht durch autosomal rezessiv vererbte Mutationen im ABCA4 Gen kommt es zur Akkumulation von toxischen Produkten im retinalen Pigmentepithel und damit letztlich zu einer zunehmenden Einschränkung der Sehkraft beider Augen. Bisher gibt es keine klinisch zugelassene kausale Therapie. Eine der für STGD1 verantwortlichen humanpathogenen Mutationen liegt im Exon 43 des ABCA4 Gens. Mithilfe von Genome Editing ist es theoretisch möglich, diese ursächlich zu therapieren. Dabei wird zunächst mit einer Endonuklease, in dieser Arbeit CRISPR/Cas9, ein Doppelstrangbruch in der Nähe der Mutation erzeugt. Die Cas9 Endonuklease braucht dazu eine effektive guideRNA, welche sie spezifisch zu der gewünschten Stelle (sog. Targetstelle) im Genom führt. Der erzeugte Doppelstrangbruch soll dann von den zelleigenen Reparaturmechanismen unter Nutzung eines DNA-Templates, welches das entsprechende wildtypische DNA-Fragment des Gens enthält, so repariert werden, dass am Ende die wildtypische Sequenz des Gens im Genom vorliegt und das funktionstüchtige Genprodukt von der Zelle hergestellt werden kann. In dieser Arbeit wurde am Schweinemodell (Sus Scrofa) gearbeitet, d.h. es wurden die porzinen Sequenzen des ABCA4 Gens verwendet. Es konnten zunächst 10 verschiedene Plasmide, sog. gRNA/Cas9-Plasmide, welche die codierenden Sequenzen sowohl für gRNAs als auch für die Cas9-Enzyme enthalten, generiert werden. Die zugehörigen Targetsequenzen der gRNAs lagen dabei in den intronischen Bereichen um das Exon 43 des porzinen ABCA4 Gens. Anschließend wurden die gRNA/Cas9-Plasmide mit einem sog. BRET-Assay auf ihre Schneideaktivität in vitro überprüft. Dabei zeigte sich, dass 6 der 10 Plasmide eine signifikante Schneideaktivität besitzen, mit 4 davon wurde weitergearbeitet. Parallel dazu wurde ein Template entworfen und hergestellt, welches aneinandergereiht die wildtypischen Sequenzen der Exons 42, 43 und 44 des porzinen ABCA4 Gens enthält. Zudem wurde ein zweites Template (MMEJ-Template) entworfen und und in das BRET-Reporter-System integriert werden. Anschließend wurde versucht, mithilfe der gRNAs und dem Cas9 Enzym die DNA-Sequenz des WT-Templates in das MMEJ-Template einzubauen und dies anschließend mit einem sog. MMEJ-Assay zu überprüfen. Es zeigte sich, dass kein Einbau des WT-Templates stattgefunden hatte. Gründe und Lösungsstrategien hierfür wurden diskutiert.