Untersuchungen zur Diversität von Actinobacteria in Innenräumen

Abstract

Bereits seit Pettenkofer 1858 wird das Leben in feuchtegeschädigten Wohnungen als gesundheitliches Risiko für die Bewohner betrachtet. Der in feuchtegeschädigten Baumaterialien vorherrschende organische Befall geht oft einher mit dem Wachstum von Schimmelpilzen, aber auch Actinobacteria. Aufgrund fehlender Informationen über die in Innenräumen vorkommenden Actinobacteria sowie der Fähigkeit verschiedener Actinobacteria Spezies (z.B. Mycobacterium sp., Nocardia sp., Saccharopolyspora sp. etc.) Infektionen oder allergische Reaktionen auszulösen sowie toxische Stoffe zu produzieren sollte ermittelt werden welche Gattungen bzw. Arten für einen Befall im Innenraum charakteristisch sind. Um die Vielfalt von Actinobacteria in Baumaterialien zu untersuchen, wurden 18 verschiedene, feuchtegeschädigte Baumaterialien sowohl kultivierungsunabhängig als auch kultivierungsabhängig untersucht. Für den kultivierungsunabhängigen Ansatz wurde zunächst ein Nachweissystem speziell für die Klasse der Actinobacteria, basierend auf der 16S rRNA Gensequenz, entwickelt und etabliert. Die Analyse komplexer Umweltproben zeigte hierbei eine 100%ige Spezifität des entwickelten Primersystems, was den Einsatz für Diversitätsuntersuchungen von Actinobacteria in Baumaterialien erlaubt. Sowohl kultivierungsunabhängig als auch kultivierungsabhängig wurden Actinobacteria mit einer hohen Abundanz in feuchtegeschädigten Baumaterialien nachgewiesen. Der Anteil der 16S rRNA Gensequenzen innerhalb der generierten Klonbibliotheken, der spezifisch Actinobacteria zugeordnet wurde, betrug im Mittel 50%. Kultivierungsabhängig wurden Actinobacteria-Konzentrationen von 1,8 x 104 bis 7,6 x 107 KBE g-1 Materialfrischgewicht detektiert. Insgesamt konnten in den feuchtegeschädigten Baumaterialien 68 verschiedene Actinobacteria-Gattungen ermittelt werden, was eine unerwartet hohe Diversität widerspiegelt. Auch wurde anhand der Neubeschreibung acht verschiedener Bakterienarten (Pseudonocardia parietis, Citricoccus parietis, Prauserella muralis, Promicromonospora umidemergens, Brevibacterium sandarkinum, Jiangella muralis, Microlunatus parietis, Kytococcus aerolatus) sowie einer neuen Bakteriengattung Murinocardiopsis (flavida) gezeigt, dass das Actinobacteria-Spektrum in Baumaterialien bisher unbekannt ist. Obwohl die Ergebnisse einer Rarefactionanalyse zeigten, dass die Artenvielfalt der Actinobacteria in feuchtegeschädigten Baumaterialien vermutlich noch größer ist, wurden die abundanten Actinobacteria-Gattungen ermittelt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Vertreter der Gattungen Streptomyces und Pseudonocardia in über 90% der Proben nachweisbar waren. Aber auch Vertreter der Gattungen Promicromonospora, Jiangella, Amycolatopsis, Nocardia, Saccharopolyspora und Nocardiopsis konnten in >= 60% der untersuchten Proben nachgewiesen werden. Erste Zusammenhänge zwischen Material- und korrespondierenden Bioaerosolproben hinsichtlich des Vorkommens gleicher Bakterienspezies konnten anhand von 16S rRNA Gen-Sequenzähnlichkeiten > 99% gezeigt werden. Hierbei wurden acht von insgesamt 28 Bioaerosolisolaten (28%) auch in den korrespondierenden Materialproben nachgewiesen. Aber auch anhand der hier erhaltenen Ergebnisse kann weder eine Aussage über eine spezifische Exposition von Bewohnen z.B. über Bioaerosole noch über einen direkten gesundheitlichen Zusammenhang bzw. Effekt getroffen werden. Allerdings wurden Bakterien nachgewiesen, die im Zusammenhang mit Erkrankungen beim Menschen stehen könnten, wie Nocardiopsis dassonvillei. Das Detailwissen zum Vorkommen abundanter und gesundheitlich bedeutsamer Actinobacteria in feuchtegeschädigten Baumaterialien ermöglicht jedoch einen gezielten Nachweis spezifischer Actinobacteria. So konnte für Saccharopolyspora rectivirgula, bekannt als Auslöser der EAA, ein spezifisches und quantitatives Nachweissystem, basierend auf der 16S rRNA Gensequenz, entwickelt und etabliert werden. Die Spezifität des hier entwickelten Real-time PCR Systems wurde durch Klonierungsanalysen aus komplexen Umweltproben bestätigt.Insgesamt belegen die vorliegenden Untersuchungen, dass die hier gewählten Methodiken zukünftig vielversprechend für Diversitätsuntersuchungen sowie die Bewertung von Innenräumen, hinsichtlich der Belastung mit Actinobacteria, eingesetzt werden können. Living in damp buildings is associated with increased health effects on residents. Here, microbial growth in water damaged building material is often related to growth of fungi and Actinobacteria. Either some Actinobacteria are known as potential pathogens like Mycobacterium tuberculosis and Saccharopolyspora rectivirgula or they are able to produce toxic metabolites like Streptomyces griseus. To analyse the diversity of Actinobacteria in building materials damaged by water eighteen different building materials were investigated by cultivation dependent and cultivation independent approaches. For cultivation independent analysis a detection system based on 16S rRNA gene sequences was established specifically for Actinobacteria. The specificity of the developed primer system was shown by generation of clone libraries from different environmental samples. These examinations guarantee the application of the primer system for diversity analyses of Actinobacteria in building materials. High abundancies of Actinobacteria in building materials damaged by water were shown both by cultivation dependent and independent analyses. The cultivation independent investigation showed high numbers of Actinobacteria inside building materials. The fraction of 16S rRNA gene sequences which were assigned positively to Actinobacteria sequences averaged 50%. Respectively, the cultivation dependent approach showed high concentrations ranging from 1.8 x 104 to 7.6 x 107 CFU g-1 fresh weight in styrofoam and plaster. Altogether, 68 different genera were detectable in the analysed building material samples, which indicate an unexpected high diversity of Actinobacteria. Furthermore, eight bacteria species and one Actinobacteria genus were described for first time (Pseudonocardia parietis, Citricoccus parietis, Prauserella muralis, Promicromonospora umidemergens, Brevibacterium sandarkinum, Jiangella muralis, Microlunatus parietis, Kytococcus aerolatus and Murinocardiopsis (flavida)). Even if the rarefaction analysis displayed that species richness was higher when investigating a major sample size, the abundant Actinobacteria genera were detected. The most frequent genera detected were Streptomyces and Pseudonocardia which were found in more than 90% of the examined samples. Species of the genera Promicromonospora, Jiangella, Amycolatopsis, Nocardia, Saccharopolyspora and Nocardiopsis were detectable in still more than 60%. This study showed the correlation of material- and corresponding bioaerosol sample for first time. The investigations showed that based on 16S rRNA sequence similarities > 99%, eight of overall 28 isolates were detected both in water damaged building material and in the corresponding bioaerosol sample. Depending on the results of the study no comments could be made, neither in respect to specific exposure of occupants nor in relevance on human health. But some species were detected which are potentially pathogenic, like Nocardiopsis dassonvillei. However, the study provides detailed information on occurring and abounding Actinobacteria in water damaged building materials. This knowledge is urgently required in consideration of prospective and selective detection of Actinobacteria relevant to health. In this study a specific quantitative Real-time PCR system for detection of S. rectivirgula, known as a causative agent for extrinsic allergic allveolitis was developed. Specificity of the deployed system was shown by cloning analyses from complex environmental samples. These results clearly demonstrated that the method mentioned above seems to be applicable for the assessment of indoor environments.