Die Rolle der Zytokeratine 8 und 18 bei der Hepatitis B Virusinfektion

Abstract

Eine chronische Hepatitis B (CHB) Virusinfektion (HBV) kann zu Leberfibrose und zirrhose, bis hin zu einem hepatozellulärem Karzinom führen. Die Pathogenese beruht hauptsächlich auf den Folgen der adaptiven, zellulären Immunantwort des Wirtes gegen infizierte Hepatozyten. Jedoch tragen auch direkte zytotoxische Effekte von viralen Komponenten, wie z.B. die Akkumulierung der Hepatitis B-Oberflächenproteine (HBs) in Hepatozyten hierzu bei. Bei einer CHB finden sich gehäuft Hyperphosphorylierungen und Mutationen der zytoprotektiven Zytokeratine 8 und 18 (CK8/18), die mit einem schwereren Krankheitsverlauf korrelieren. Zudem ist eine Reihe von CK-Pathogen-Interaktionen bekannt, die einen Einfluss von CK auf die Infektion, Replikation oder Freisetzung der Pathogene aus ihren Wirtszellen zeigen.Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst ein für HBs-Proteine transgenes und durch Doxyzyklin-induzierbares in vitro Zellkulturmodell geschaffen, um ihre subzelluläre Lokalisierung und Verteilung zu untersuchen. Das kleine HBs-Protein (SHBs) lag nach Expression in allen drei Zelllinien (humane bzw. murine Hepatomzellen Huh7 und AML-12, murine Fibroblastenzellen NIH3T3) intrazellulär fein verteilt vor. Das große HBs-Protein (LHBs) war ebenfalls in Huh7- und AML-Zellen fein verteilt, wobei AML-12 teilweise auch zusätzliche LHBs-Aggregate bildeten. Ausschließlich LHBs-Aggregate fanden sich dagegen in NIH3T3-Zellen. Während keine CK8/18-Proteine in NIH3T3 nachweisbar waren, wiesen Huh7 und AML-12 eine hohe CK8/18-Expression auf, wobei AML-12 ein niedrigeres CK18 zu CK8-Verhältnis aufwiesen. Eine CK18-Expression in NIH3T3 konnte im Gegensatz zur Überexpression des Chaperons BiP (Binding immunoglobulin protein) die LHBs-Aggregatbildung verhindern. NIH3T3 wiesen im Vergleich zu Huh7 und AML-12 eine erhöhte N-Glykosylierung des LHBs auf, dessen Inhibierung jedoch nicht die Aggregatbildung in NIH3T3 verhindern konnte. Mittels Konfokalmikroskopie wurde eine Kolokalisation von LHBs mit CK8/18 nachgewiesen. Zudem war LHBs mit dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) kolokalisiert, jedoch nicht mit dem Golgi-Apparat. Eine Interaktion von LHBs mit CK8/18 wurde durch Einsatz des Phosphatase-Inhibitors Okadainsäure (OA) angezeigt und wurde für CK18 mittels Proximity Ligation Assays nachgewiesen. Dagegen interagierte LHBs kaum mit Mikrofilamenten und Mikrotubuli. Eine direkte Bindung von CK8/18 an die myristylierte NTCP (Na+/taurocholate cotransporting polypeptide)-Rezeptorbindungsdömane von präS1-LHBs wurde mittels Oberflächen-Plasmonresonanz-Spektroskopie nachgewiesen. Bei HBV-Infektionsexperimenten mit primären Hepatozyten aus Tupaia belangeri (PTH) wurde kein Einfluss von extrazellulär-applizierten CK8/18-Proteinen auf die Infektion festgestellt, was wahrscheinlich an der schlechten Löslichkeit der eingesetzten CKs lag. Dagegen führte OA zu einer Verdopplung der Infektionsrate ohne die Sekretion der HBs-Proteine zu beeinflussen. Eine Verifizierung dieser Ergebnisse ist jedoch aufgrund der unspezifischen Wirkung von OA erforderlich. Die Zytokeratine 8 und 18 regulieren die intrazelluläre Verteilung von LHBs und könnten möglicherweise einen Einfluss auf die HBV-Infektion haben. Diese neuen Erkenntnisse könnten bedeutsam für innovative therapeutische Optionen in der HBV-Therapie sein.

Chronic hepatitis B (CHB) virus infections (HBV) can lead to fibrosis and cirrhosis of the human liver and even to development of hepatocellular carcinoma. The pathogenesis is mainly due to the responses of the host´s adaptive cellular immune system against infected hepatocytes. However, direct cytotoxic effects of viral components such as the accumulation and aggregation of hepatitis B surface (HBs) proteins in infected hepatocytes play also a role. In patients with CHB, hyperphosphorylated and/or mutated forms of CK8 and CK18 (CK8/18) are often found in hepatocytes, that correlate with a more severe disease course. In addition, a number of cytokeratin-pathogen interactions are known to show effects of CKs on the infection, replication and release of these pathogens from their host cells. For this study an in vitro cell culture model for the transgenic and doxycycline-inducible expression of HBs proteins was generated to investigate their subcellular localization and distribution. Expression of the small HBs protein (SHBs) led to its fine distribution within the cytoplasm of all three cell lines tested (human hepatoma Huh7, mouse hepatoma AML-12, mouse fibroblast NIH3T3). Expression of the large HBs protein (LHBs) led also to its fine distribution within Huh7 and AML-12 cells, whereby the latter displayed LHBs aggregates in several cells additionally. In contrast, NIH3T3 cells formed dense aggregates of LHBs only. No CK8/18 was detectable in NIH3T3 cells, but a high expression of CK8/18 was found in Huh7 and AML-12 cells, whereby AML-12 displayed a lower CK18 to CK8 ratio. An artificial CK18 expression in NIH3T3 was able to prevent LHBs aggregate formation, whereas overexpression of the chaperone BiP (Binding immunoglobulin protein) did not change LHBs distribution. A higher N-glycosylation was detectable in NIH3T3 than in Huh7 and AML-12 cells, whose inhibition was not able to prevent LHBs aggregation in NIH3T3. Confocal microscopy revealed a colocalization of LHBs with CK8/18. Furthermore, LHBs was colocalized with the endoplasmic reticulum (ER), but not with Golgi apparatus. An interaction of LHBs with CK8/18 was indicated by use of the phosphatase inhibitor ocadaic acid (OA) and had been proved for CK18 with proximity ligation assay. In contrast, microfilaments and microtubules hardly interacted with LHBs. Surface plasmon resonance spectroscopy detected a direct binding of CK8/18 with the myristoylated NTCP (sodium taurocholate cotransporting polypeptide) receptor-binding preS1 domain of LHBs. A HBV infection experiment with primary hepatocytes from Tupaia belangeri (PTH) could not show an influence of extracellularly applied CK8/18 proteins on HBV infection, which was probably due to solubility reasons of the CKs used. In contrast, OA doubled infection rate in a HBV infection experiment with PTH without changing secretion of HBs proteins. However, because of non-specific effects of OA, a verification of these results is necessary.Cytokeratins 8 and 18 regulate the intracellular distribution of LHBs and could possibly have an influence on HBV infection. These new findings might be relevant for novel therapeutic options in HBV therapy.