Zoonotisches Potenzial neu entdeckter Orthohepadnaviren aus Fledermäusen und die Charakterisierung der Virus-Rezeptor Interaktionen des Hepatitis B Virus
Das Hepatitis-B-Virus (HBV) des Menschen ist der Erreger der Hepatitis B und ein Vertreter der viralen Familie der Hepadnaviridae, die sich durch einen engen Wirts- und Organtropismus auszeichnet. Die Avihepadnaviren infizieren jeweils einzelne Vogelarten, während die Orthohepadnaviren ihre Wirte innerhalb der Säugetiere haben. Erst 2013 wurden weitere Orthohepadnavirusarten entdeckt, nun überraschenderweise in verschiedenen Spezies der Säugetierordnung Chiroptera (Fledertiere). Dazu gehören die drei hier beschriebenen Fledermaus (engl. Bat)-Orthohepadnaviren (BATHBV), der Wirtstierarten tent making bats TBHBV, horseshoe bats HBHBV, roundleaf bats RBHBV und das LBHBV der long-fingered bat. Phylogenetisch gruppieren die BATHBVs zwischen den Viren der Nagetiere (Rodentia) und der Primaten und Menschen. Insbesondere die Gesamtgenom-Sequenz des BATHBV der als tent-making bat bezeichneten Neuwelt-Fledermaus, Uroderma bilobatum, (TBHBV) ist am engsten mit dem WMHBV des Neuwelt Wollaffen und den humanen HBV Genotypen (F und H) aus Mittel- und Südamerika verwandt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich diese phylogenetischen Verhältnisse auch im zoonotischen Potenzial der Viren widerspiegeln. Während intermediäre und späte Schritte (Proteinexpression, Genom-Replikation, Sekretion) im hepadnaviralen Replikationszyklus von allen BATHBV in humanen Hepatozytenkulturen mit ähnlicher Effizienz stattfinden, konnten wesentliche Unterschiede innerhalb der frühen Infektionsschritte festgestellt werden. Eine HBV-Infektion von primären Hepatozyten konnte durch Vorbehandlung mit viralen myristoylierten präS1-analogen Peptiden (Myr-präS1-Peptiden) mit der AS-Sequenz der entsprechenden Virusarten aus verschiedenen Wirtsorganismen inhibiert werden. Während die Myr-präS1-Peptide der Primaten-HBVs (HBV und WMHBV) sowie des TBHBV bei einer ähnlich niedrigen Konzentration (IC50: < 4 nM) eine HBV-Infektion von primären humanen Hepatozyten inhibieren, war die IC50 der Myr-präS1-Peptide des HBHBV und RBHBV um das 57- bzw. 41-fache höher. In Infektionsexperimenten mit Hepatitis-Delta-Viruskonstrukten, die mit den Oberflächenproteinen von HBV, TBHBV, HBHBV und RBHBV pseudotypisiert (d. h. umhüllt) waren, ermöglichten nur die Oberflächenproteine des TBHBV, nicht aber die von HBHBV und RBHBV, eine Infektion von HBV-suszeptiblen Zellen. Daher geht von TBHBV mutmaßlich eine zoonotische Gefährdung aus. Die Myr-präS1-Peptide des HBHBV und RBHBV zeigten zwar eine schwache Bindung an humane Hepatozyten und bewirkten bei hohen Konzentrationen eine Inhibition der HBV-Infektion; anhand der hier verwendeten in vitro Infektionssysteme konnte aber kein zoonotisches Potenzial dieser Viren festgestellt werden.Der Leber-spezifische Gallensalztransporter NTCP (SLC10A1) wurde in 2012 als ein funktioneller Rezeptor für HBV und HDV identifiziert. Die Expression des NTCP verschwindet wenige Tage nach Explantation der primären Hepatozyten und fehlt bei Hepatomzellen (z.B. HepG2) ganz. Jedoch können Hepatomzellen mit einem Expressionsvektor für NTCP transfiziert werden und sind dann infizierbar. Im humanen NTCP sind die AS 157-165 sowie 84-87 essenziell für eine HBV- und HDV- Infektion. Auf der viralen Seite sind die 48 N-terminalen AS der präS1-Domäne des großen HBV-Oberflächenproteins sowie deren N-terminale Myristoylierung und besonders die AS 9-15 der präS1-Domäne für die HBV-Bindung und für eine erfolgreichen Infektion von Hepatozyten essenziell. In der hier vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die dem NTCP auf Sequenz-, Struktur- und Funktionsebene sehr ähnlichen Transporter der SLC10 Familie (der Ileum spezifische ASBT bzw. SLC10A2, und der Gonaden-spezifischen SOAT bzw. SLC10A6) keine HBV-Suszeptibilität in Hepatomzellen vermitteln. Auch eine Integration der oben beschriebenenen HBV-infektionsrelevanten NTCP-AS-Sequenzen 157-165 sowie 84-87 in die entsprechende Position des ASBT und SOAT bewirkten keine Myr-präS1-Peptidbindung oder HBV-Suszeptibilität. So scheint neben der Speziespezifität auch die Gewebespezifität des HBV durch den NTCP mitbestimmt zu werden. Interessanterweise konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass die natürliche Funktion des NTCP als Gallensalztransporter mit der Fähigkeit korreliert, das Myr-präS1-Peptid des HBV zu binden. Dies zeigte sich darin, dass ein Überschuss an Gallensalzen konzentrationsabhängig die Bindung des Myr-präS1-Peptids an den NTCP inhibierte. Umgekehrt behindert die Myr-präS1-Peptid-Bindung den NTCP-spezifischen Gallensalztransport von Hepatozyten. Außerdem wurde gezeigt, dass Natriumionen, die für den Gallensalztransport des NTCP benötigt werden, auch für die Infektion des HBV notwendig sind. Die genauen molekularen Interaktionen, die während der Bindung zwischen der HBV Myr-präS1-Domäne und dem NTCP stattfinden und zu einer Aufnahme des Virus in die Zelle führen, sind noch unbekannt. In dieser Studie konnte jedoch durch konfokale Laser Scanning Mikroskopie erstmals gezeigt werden, dass ein Fluorophor-konjugiertes Myr-präS1-Peptid (2-48) des HBV bei <10°C spezifisch an NTCP-haltige Membranbereiche von lebenden HepG2-Zellen bindet und dass bei 37°C das Myr-präS1-Peptid zusammen mit dem NTCP langsam innerhalb von 30-60 Min in die Zelle aufgenommen wird. Diese Ergebnisse deuten an, dass das Virus komplexiert mit einem oder mehreren NTCP-Molekülen endozytiert wird.
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