Charakterisierung früher Immunreaktionen gegen Toxoplasma gondii-Tachyzoiten in primären Monozyten und THP-1-Zellphänotypen, einschließlich Validierung eines THP-1-Zellen-basierten mononukleären Phagozyten-Modells
Loading...
Date
Authors
Advisors/Reviewers
Further Contributors
Contributing Institutions
Publisher
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
License
Quotable link
DOI:
https://doi.org/10.22029/jlupub-21364Abstract
Die Zellen des angeborenen Immunsystems stellen die entscheidende erste Abwehr gegen invasive Pathogene dar. Zu ihren klassischen Effektormechanismen gehören die Phagozytose von Pathogenen, die Produktion antimikrobieller Moleküle sowie die Sekretion von immunmodulierenden Zytokinen und Chemokinen. Im Jahr 2004 wurde zum ersten Mal beschrieben, dass neutrophile Granulozyten als Reaktion auf Gram-positive oder Gram-negative Bakterien extracellular traps (ETs) freisetzen können, welche aus DNA und antimikrobiellen Proteinen wie Histonen und dem Enzym Myeloperoxidase (MPO) bestehen. In den darauffolgenden Jahren wurde gezeigt, dass andere Zellen des angeborenen Immunsystems wie Monozyten und Makrophagen ETs freisetzen, welche als monocyte bzw. macrophage extracellular traps (METs) bezeichnet werden. Zu den Funktionen von ETs gehören das Einfangen, die Immobilisierung und in manchen Fällen auch die Abtötung von Pathogenen. Zu Beginn dieser Arbeit gab es nur einen Bericht über die Toxoplasma gondii (T. gondii)-induzierte MET-Freisetzung, die von Monozyten von Seehunden stammten. T. gondii, der Erreger der Toxoplasmose, ist ein obligat intrazellulärer Parasit aus dem Stamm der Apikomplexa, welcher alle warmblütigen Lebewesen als Zwischenwirt sowie Katzen (Felidae) als Endwirt infiziert. In diesen Wirten lösen sich schnell teilende Tachyzoiten während der systemischen Ausbreitung eine angeborene und adaptive Immunantwort aus. Einige Tachyzoiten wandeln sich in Gewebezysten in Bradyzoiten um. In diesen können Bradyzoiten viele Jahre persistieren und im Falle einer Immunschwäche reaktiviert werden. Die vorliegende Arbeit untersuchte frühe (< 4 Stunden) angeborene Immunantworten mononukleärer Phagozyten gegen vitale T. gondii-Tachyzoiten in primären humanen und bovinen Monozyten sowie in der humanen monozytären Leukämie-Zelllinie THP-1 (engl. = Tohoku Hospital Pediatrics-1). Dabei wurde eine 4-stündige Ko-Kultur von Immunzellen und T. gondii-Tachyzoiten unter Verwendung einer Multiplizität der Infektion (MOI, engl. = multiplicity of infection) von 1:4 (Zelle:Parasit) verwendet (mit Ausnahme der Stoffwechselanalysen mit einer verlängerten Konfrontationszeit von 6 Stunden). Die in vitro-Differenzierung von monozytären THP-1-Zellen zu unspezifischen M0-Makrophagen sowie die in vitro-Polarisierung von M0-Makrophagen zu pro-inflammatorischen M1- und anti-inflammatorischen M2-Makrophagen ermöglichte es, den aktuellen Forschungsfokus auch auf verschiedene Makrophagen-Typen auszuweiten. Darüber hinaus ermöglichte die vergleichende Untersuchung von primären Immunzellen und den entsprechenden THP-1-Zelltypen der grundlegenden Frage nachzugehen, ob eine permanente Zelllinie für die Erforschung der immunologischen Aspekte in dieser Arbeit geeignet ist. Zu Beginn dieser Arbeit fehlten zuverlässige und standardisierte Protokolle zur Differenzierung und Polarisierung von M0/M1/M2-ähnlichen Makrophagen (THP-1-M0/M1/M2-Makrophagen), welche zunächst von den Kooperationspartnern etabliert werden mussten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die korrekte Differenzierung und Polarisierung von THP-1-M0/M1/M2-Makrophagen anhand der Morphologie, der IL-1β-Sekretion, der Expression von pro- und anti-inflammatorischen Oberflächenmarkern sowie anhand der Stoffwechselprofile (Glykolyse, Glutaminolyse und Serinolyse) verifiziert und bestätigt. Mikroskopische Analysen unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM, engl. = scanning electron microscopy), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Immunfluoreszenzmikroskopie (IFM) bestätigten die Aktivierung von primären humanen und bovinen Monozyten sowie von monozytären THP-1-Zellen und THP-1-Makrophagen (M0/M1/M2) nach Konfrontation mit T. gondii-Tachyzoiten. Das grundsätzliche Vorhandensein von METs nach der Parasitenkonfrontation wurde durch den Nachweis der Ko-Lokalisation von Histonen, MPO in den DNA-reichen Strukturen bestätigt, die von mononukleären Phagozyten freigesetzt wurden. Quantitative Analysen, welche auf der Bestimmung der Anzahl MET-positiver Zellen, der Freisetzung von extrazellulärer DNA (extDNA) und der Ausdehnung der Zellkernfläche (NAE, engl. = nuclear area expansion) in Immunzellen basierten, schlugen jedoch bei primären humanen und bovinen Monozyten, monozytären THP-1-Zellen und THP-1-Makrophagen (M0/M1/M2) fehl. Ebenso erreichte die durch MET-Induktoren A23187 und Nigericin induzierte MET-Freisetzung bei Primärzellen und THP-1-Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen keine statistische Signifikanz. In den letztgenannten Fällen deuteten signifikant erhöhte Laktat-Dehydrogenase (LDH)-Aktivitäten, die in Zellkulturüberständen nachgewiesen wurden, auf eine hohe Rate an Zelltod und Zelllyse hin. Die vorliegenden Analysen der Zytokin-Sekretion zeigten einen signifikanten Anstieg der IL-1β-Sekretion durch primäre, humane Monozyten, die mit T. gondii-Tachyzoiten allein oder in Kombination mit Lipopolysaccharid (LPS) konfrontiert wurden. In THP-1-Makrophagen (M0/M1/M2) induzierte jedoch nur die kombinierte Konfrontation mit T. gondii-Tachyzoiten und LPS die IL-1β-Sekretion. Im Gegensatz dazu hatten in monozytären THP-1-Zellen weder Tachyzoiten, allein noch in Kombination mit LPS, einen Einfluss auf die IL-1β-Sekretion. Im Falle von IL-6 wurde in primären humanen Monozyten nach Konfrontation mit T. gondii-Tachyzoiten allein oder in Kombination mit LPS eine signifikant verstärkte Sekretion beobachtet. In monozytären THP-1-Zellen stieg die IL-6-Sekretion nur bei einer kombinierten Behandlung mit T. gondii-Tachyzoiten und LPS an, während THP-1-Makrophagen (M0/M1/M2) nicht mit einer signifikanten IL-6-Sekretion reagierten. Zudem beeinflusste die Konfrontation primärer humaner und boviner Monozyten mit T. gondii-Tachyzoiten weder die Expression der Immunrezeptoren TLR2 und TLR4 noch den Zytoskelett-assoziierten Marker F-Aktin oder den Migrations-assoziierten Marker CD11b. Ebenso wurden keine Parasiten-bedingten Veränderungen der Umsatzraten von Substraten und Metaboliten der Glykolyse, Glutaminolyse und Serinolyse in Zellkulturüberständen von THP-1-Zellen festgestellt. Zusammenfassend deuten die vorliegenden Ergebnisse darauf hin, dass die Sekretion von IL-1β und nicht die Freisetzung von METs entscheidend für die Auslösung der angeborenen Immunantwort in den ersten 4 Stunden nach Kontakt zwischen primären humanen und bovinen Monozyten mit T. gondii-Tachyzoiten ist. Darüber hinaus zeigte die Validierung des für die THP-1-Zelllinie entwickelten in vitro-Differenzierungs- und Polarisierungsprotokolls zur Generierung von THP-1-Makrophagen eine gute Übereinstimmung mit den in der Literatur beschriebenen Merkmalen primärer und in vitro-generierter M1- und M2-Makrophagen. Dies betrifft die Expression pro- und anti-inflammatorischer Oberflächenmarker, die Sekretion von IL-1β und das Glykolyse-, Glutaminolyse-, Serinolyse- und energiebezogene Stoffwechselprofil. Das neuartige Differenzierungs- und Polarisierungsprotokoll steht nun für weitere immunologische Untersuchungen zur Verfügung.Link to publications or other datasets
Description
Notes
Original publication in
Gießen: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, 2026