Blaulichtabhängige Genregulation in Rhodobacter sphaeroides : Untersuchungen zur physiologischen Funktion der Blaulichtphotorezeptoren AppA, CryB und LOV
Licht stellt einen bedeutenden Umweltfaktor der Photosynthesegenregulation von phototropen Organismen dar. Da es neben seiner Funktion als Energieträger auch schädlichen Einfluss haben kann, müssen phototrophe Organismen Mechanismen entwickeln, um vorhandene Lichtreize in eine Genantwort umzusetzen. Blaulichtrezeptoren stellen dabei die häufigsten Proteine zur Lichtwahrnehmung in Prokaryoten dar und erlauben es ihnen, ihre Genantwort an die Bedingungen der Außenwelt anzupassen. In R. sphaeroides existieren mit dem AppA / PpsR und dem PrrB / PrrA - System bereits zwei Systeme mit einer gut charakterisierten Wirkung auf die Expression der Photosynthesegene. Kürzlich wurden mit dem Cryptochrom CryB und dem LOV - Domänen - Protein LOV zwei weitere Blaulichtrezeptoren in R. sphaeroides beschrieben. Während für das CryB - Protein eine Verbindung zur Regulation des Photosyntheseapparates hergestellt werden konnte, blieb die physiologische Rolle des LOV - Proteins noch unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es das Verständnis der in vivo - Funktion dieser Proteine in R. sphaeroides zu verbessern. Durch die Analyse der Blaulichtsensitivität der BLUF - Domäne des AppA - Proteins konnte gezeigt werden, dass bereits minimale Blaulichtintensitäten ausreichen, um die Expression der Photosynthesegene bei gleichzeitigem Vorhandensein von Licht und Sauerstoff zu verhindern. Der lichtabhängige Anstieg der Photosynthesegenexpression bei geringem Sauerstoffpartialdruck durch das PrrB / PrrA - System konnte nur durch deutlich höhere Lichtintensitäten erreicht werden. Eine durchgeführte random Mutagenese der BLUF - Domäne führte nicht zu neuen Erkenntnissen zur Interaktion der BLUF - Domäne von AppA mit dem C - Terminus. Dafür konnte durch zielgerichtete Mutagenese von am Photozyklus beteiligen Aminosäuren gezeigt werden, dass Tryptophan 104 trotz seiner umstrittenen Rolle im Photozyklus in in vitro - Experimenten, in vivo die Blaulichtsensitivität der BLUF - Domäne beeinflussen kann. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass ein Basenaustausch des konservierten Tyrosin 21 immer zum Verlust der in vivo - Aktivität der BLUF - Domäne führt. Eine Doppelmutante führte überraschenderweise zur Wiederherstellung der in vivo - Aktivität der BLUF - Domäne, während in vitro das Protein keinen Photozyklus mehr besaß. Zur genaueren Eingrenzung des regulatorischen Einflusses des CryB - Proteins wurde dessen Interaktion mit bereits bekannten Regulatorproteinen untersucht. Dabei konnte im Yeast - Two - Hybrid - System sowie in den anschließend durchgeführten pulldown - assays eine Interaktion von CryB mit dem redox - sensitiven C - Terminus von AppA nachgewiesen werden. Die Interaktion von AppA mit PpsR wurde jedoch in Gel - Retardations - assays nicht durch die Anwesenheit von CryB beeinflusst. Für das LOV - und das CryB - Protein konnte im Yeast - Two - Hybrid - System zudem eine Interaktion mit Kapselpolysaccharidtransportern nachgewiesen werden. Es konnte jedoch keine Kapselbildung in den verwendeten R. sphaeroides - Stämmen gezeigt werden. Um die bisher völlig unbekannte physiologische Rolle des LOV - Proteins zu untersuchen, wurde ein microarray - Transkriptomchip von Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 erstellt. Mit diesem wurde nach im Wildtyp 2.4.1 und der deltalov - Mutante differenziell exprimierten Genen, nach mikroaerobem Wachstum, Blaulichtbestrahlung und photooxidativem Stress, gesucht. In den Transkriptomanalysen konnten dabei eine große Zahl von Genen des Kohlenhydrat - und Aminosäurestoffwechsels und - transports, sowie der generellen Stressantwort identifiziert werden, welche durch den Einfluss des LOV - Proteins reprimiert werden. Gleichzeitig führte das Fehlen des LOV - Proteins zur Verringerung der Expression von Genen der Translation. Aus diesen Beobachtungen kann eine mögliche Beteiligung von LOV an der Regulation der stringent response gemutmaßt werden, deren Bestätigung jedoch noch weitere Untersuchungen erfordert.
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