Establishment and Characterisation of a Clinically Relevant Metaphyseal Fracture Model in the Distal Femur of Skeletally Matured Sheep

Abstract

Despite the high incidence of metaphyseal bone fractures in patients, the cellular and molecular mechanisms underlying the healing process of metaphyseal fractures are still poorly understood due to the unavailability of suitable experimental animal models. The intention of the current work was to establish a novel clinically relevant large animal model for metaphyseal bone healing in the distal femur of skeletally matured sheep. In contrast to commonly used partial osteotomy models, this model employed a complete wedge-shaped osteotomy at the metaphysis. The osteotomy was stabilised internally with a customised anatomical locking titanium plate that allowed immediate postoperative full weight bearing. Bone healing was evaluated at 12 weeks post-fracture relative to the unoperated contralateral femur. No plate breakage or secondary fracture was recorded in the animals. Histological and micro-computed tomography results revealed an increased amount of mineralised and dense trabeculae with rich bone marrow. The new trabeculae healed via direct intramembranous ossification without visible callus and cartilaginous tissue formation. Functional morphological analysis of the osteocyte-lacuna revealed regularly arranged spherically shaped osteocytes-lacunae along with the canaliculi system. The biomechanical test revealed a comparable stiffness in both operated and unoperated femurs. However, the stiffness at their cortical regions was two-fold more than in their trabecular regions. Histomorphometric assessment of two major bone matrix enzymes: ALP (osteoblast marker) and TRAP (osteoclast marker) revealed a significantly higher ALP activity in the operated femur. Bone remodelling was evident by the expressed bone formation markers (COL1A1, ALP, BGLAP, BMP2, ASMA, OPG) and bone resorption markers (RANKL, CTSK) as revealed by quantitative PCR and immunohistochemistry. Bone surface biochemical analysis using time-of-flight secondary ion mass spectrometry showed high, and a homogeneously distributed calcium and collagenous components. Ultrastructural imaging of the new trabeculae revealed a characteristic parallel arrangement of the collagen fibrils uniformly mineralised by the dense mineral substance. Active osteoblasts were characterised by their plump cuboidal-shape, abundant rough endoplasmic reticulum, and a distinct Golgi apparatus whereas active osteoclasts were characterised by their large size, multiple nuclei and a ruffled border. The ultrastructure of the osteocytes varied according to the mineralisation level. The matured star-shaped osteocytes embedded inside the fully mineralised bone whereas young osteocytes embedded within the osteoid or partially mineralised bone areas. In conclusion, this newly established metaphyseal fracture model is of interest to study bone healing and treatment options for the enhancement of metaphyseal fractures. Ungeachtet einer hohen Inzidenz für metaphysäre Frakturen beim Menschen sind die dem Heilungsprozess unterliegenden zellulären und molekularen Mechanismen immer noch unzureichend bekannt, was in erster Linie durch das Fehlen klinisch relevanter Tiermodelle zu begründen ist. In der vorliegenden Studie wurde ein neuartiges, klinisch relevantes Großtier-Modell für die metaphysäre Knochenheilung im distalen Femur ausgewachsener Schafe etabliert. Im Gegensatz zu normalerweise genutzten partiellen Osteotomien realisierte dieses Modell eine durchgehende keilförmige Osteotomie im Bereich der Metaphyse. Die Osteotomie wurde durch eine anatomische winkelstablie Platte stabilisiert, welche postoperativ sofort eine Vollbelastung erlaubte. 12 Wochen nach der Operation wurde die Knochenheilung in Relation zur gesunden kontralateralen Seite evaluiert. Bei den Tieren traten weder Plattenbrüche noch Sekundärfrakturen auf. Histologische und µ-computertomografische Ergebnisse zeigten eine große Menge mineralisierten Knochens sowie verdichtete Knochentrabekel und reichlich Knochenmark. Neue Knochentrabekel entstan¬den durch desmale Ossifikation ohne sichtbare Knorpel- oder Kallusbildung. Eine spezifische morphologische Analyse der Osteozytenlakunen veranschaulichte regelmäßig angeordnete sphärische Lakunen zusammen mit den zugehörigen Knochenkanälchen. Biomechanische Tests demonstrierten eine vergleichbare Steifigkeit in den operierten und nicht operierten Femora. Dabei war die Steifigkeit in den kortikalen doppelt so hoch wie in den trabekulären Regionen. Histomorphometrische Analysen zweier wichtiger Knochenmatrix-Enzyme, der ALP (als Osteoblasten-Marker) und der TRAP (als Osteoklasten-Marker), ergaben eine signifikant erhöhte ALP-Aktivität im operierten Femur. Sowohl durch immunhistochemische Färbungen als auch mithilfe der quantitativen PCR konnten aktive Knochenumbau-Prozesse durch die Expression der knochenaufbauenden Marker Col1A1, ALP, BGLAP, BMP2, ASMA, OPG sowie der knochenabbauenden Marker TRAP und CTSK nachgewiesen werden. Die biochemische Analyse der Knochenoberfläche durch die time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) ergab eine große Menge gleichmäßig verteilten Kalziums wie auch kollagener Komponenten. Die ultrastrukturelle Untersuchung der neu gebildeten Trabekel zeigte charakteristisch parallel angeordnete und gleichmäßig dicht mineralisierte Kollagen-Fibrillen. Aktive Osteoblasten konnten anhand ihrer würfelförmigen Gestalt, des zahlreich vorkommenden rauen endoplas¬matischen Retikulums sowie eines auffälligen Golgi-Apparates identifiziert werden, während die aktiven Osteoklasten durch ihre Größe, die Mehrkernigkeit und ein ruffled border geprägt waren. Die Ultrastruktur der Osteozyten variierte dem Mineralisierungslevel entsprechend. Reife sternförmige Osteozyten lagen eingeschlossen in vollständig mineralisierter Knochen¬matrix, während sich junge Osteozyten im Bereich des Osteoids, bzw. teilweise in mineralisierte Matrix eingebettet fanden. Zusammenfassend ist zu sagen, dass dieses neu etablierte metaphysäre Fraktur-Modell im Schaf zukünftig für die Untersuchung der Knochenheilung und für neue Therapien zur Stimulation zur Heilung bei metaphysärern Frakturen genutz werden kann.