Genetic diversity in Brassica napus and association studies with seed glucosinolate content

Abstract

Today oilseed rape (B. napus ssp. napus) is the most important source of vegetable oil in Europe and the second most important oilseed crop in the world after soybean. However, breeding of oilseed rape has evoked a strong bottleneck selection towards double-low (00, canola) seed quality with zero erucic acid and low seed glucosinolate content. Genetic diversity throughout the rapeseed primary gene pool was examined by obtaining detailed molecular genetic information at simple sequence repeat (SSR) loci for a broad range of winter and spring oilseed, fodder and leaf rape gene bank accessions. A set of 96 genotypes was characterised using publicly available mapped SSR markers spread over the B. napus genome. Allelic information from 30 SSR primer combinations amplifying 220 alleles at 51 polymorphic loci provided unique genetic fingerprints for all genotypes. UPGMA clustering enabled the Überidentifikation of four general groups with increasing genetic diversity as follows (1) spring oilseed and fodder; (2) winter oilseed; (3) winter fodder; (4) vegetable genotypes. The diverse spring and winter oilseed genotypes identified in the study may represent a useful resource for improving heterotic potential in spring and winter oilseed rape, respectively. In this regard the highly genetically distinct winter oilseed varieties "Mytnickij", "Kromerska", "Mestnij" and "Krapphauser" represent a potentially valuable resource for winter oilseed rape breeding, whereas "Dux" (Germany) and "Wesway" (Australia) could be of interest for diversifying the spring oilseed rape gene pool. Moreover a considerable genetic variation was identified in B. napus vegetable and fodder rape genotypes compared to the gene pools of conventional spring and winter oilseed material. The molecular genetic information gained enables the identification of untapped genetic variability for rapeseed breeding and is potentially interesting with respect to increasing heterosis in oilseed rape hybrids. The results of this study demonstrate the suitability of SSR data for analysis of genetic diversity in B. napus genotypes.Using this set of genetically diverse genotypes, structure-based allele-trait association studies were conducted to identify potentially gene-linked markers for important seed glucosinolate loci. The analyses included a set of new SSR markers whose orthologs in Arabidopsis thaliana are physically closely linked to promising candidate genes for glucosinolate biosynthesis. Using 62 polymorphic SSR primer combinations, a total of 348 polymorphic SSR marker alleles were amplified in the 94 gene bank accessions. Associations between the marker data and the total seed glucosinolate content were tested using the logistic regression approach. A total of 51 marker alleles from 29 SSR primer combinations were found to exhibit a significant association (P≤0.05) to total seed glucosinolate content. The results indicate that four genes involved in the biosynthesis of indole, aliphatic and aromatic glucosinolates might be associated with known QTL for total seed glucosinolate content in B. napus. Markers linked to homoeologous loci of these genes in the paleopolyploid B. napus genome were found to be associated with a significant effect on the seed glucosinolate content. Inter-crossing of different high-glucosinolate genotypes that contain complementary marker alleles associated with reduced total glucosinolate content at different gene loci should result in transgressive segregation with the possibility for marker-assisted pyramiding of positive alleles at all major loci. This could open the way for the development of new, genetically-diverse heterotic pools for hybrid breeding.Genome-wide SSR marker data and population structure information were generated that provide a useful starting point for structure-based association analyses of other phenotypic traits in this B. napus core collection. Furthermore, a new procedure was developed and successfully applied for the identification of potentially gene-linked SSR markers based on Brassica-Arabidopsis comparative genome analysis. In the future, this method could be applied for marker development, allele-trait association studies and marker-assisted selection for numerous important quantitative traits in B. napus and other Brassica crop species. Raps (B. napus ssp. napus) stellt die wichtigste Ölsaat in Europa und nach der Sojabohne die zweitwichtigste Ölsaat weltweit dar. Die Züchtung von Qualitätsraps, d.h. 00-Sorten weitgehend ohne Erucasäure (C22:1) und mit einem geringen Glucosinolat-Gehalt, haben im aktuellen Zuchtmaterial zu einem "Flaschenhals-Effekt", d.h. zu einer gewissen Einschränkung der Diversität, geführt. Aus diesem Grunde sollte in der vorliegenden Arbeit die genetische Diversität innerhalb des primären Raps-Genpools anhand eines breiten Sortimentes von Winter- und Sommerraps, Futterraps und Genbankakzessionen mithilfe von Mikrosatelliten (simple-sequence-repeats, SSR) untersucht werden, um detaillierte genetische Informationen zu den betreffenden genetischen Loci zu erhalten. Mittels öffentlich verfügbarer SSR-Marker, die das gesamte Genom von B. napus abdecken, wurde ein Set von 96 Rapsgenotypen charakterisiert. Insgesamt 30 SSR Primerkombinationen mit 220 Allelen, von denen 51 polymorph waren, lieferten allelische Informationen, die die Darstellung eines individuellen genetischen Fingerabdrucks für jeden einzelnen Genotyp ermöglichten.Mit diesen Daten konnten anhand einer Cluster-Analyse (UPGMA-Cluster) vier Hauptgruppen mit einer erhöhten genetischen Diversität zueinander identifiziert werden: (1) Sommerraps und Futterraps; (2) Winterraps; (3) Winterfutterraps und (4) Gemüseraps. Die identifizierten Winter- und Sommerraps-Genotypen repräsentieren eine nützliche Ressource für eine verbesserte Nutzung der Heterosis (Bastardwüchsigkeit) in dem Zuchtmaterial. In diesem Zusammenhang stellen die genetisch stark diversen Winterrapssorten "Mytnickij", "Kromerska", "Mestnij" und "Krapphauser" eine potentielle, wertvolle Quelle für die Winterrapszüchtung dar. Dagegen dürften die Sommerrapssorten "Dux" (Deutschland) und "Wesway" (Australien) sehr nützlich sein, um die genetische Diversität innerhalb des Genpools als Voraussetzung für eine effektive Sommerrapszüchtung zu steigern. Weiterhin wurde im Vergleich zu den Genpools konventioneller Sommer- und Winterrapsformen in den Gemüseraps- und Futterrapsgenotypen eine beachtliche genetische Variation identifiziert. Die molekulargenetischen Daten ermöglichten die Identifizierung bisher nicht genutzter genetischer Variabilität für die Rapszüchtung, was in Bezug auf die Züchtung von Hybridsorten mit einem gesteigerten Heterosiseffekt von großer Bedeutung ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass SSR-Marker nützliche Werkzeuge für die Rapszüchtung sind, insbesondere um die genetische Diversität in B. napus-Genotypen aufzudecken.Des weiteren wurden die 96 Genotypen genutzt, um für prominente Glucosinolat-Loci genomstrukturbasierte Allel-Merkmal Assoziationsstudien durchzuführen, die zur Identifizierung von gekoppelten Markern dienten. Diese Analysen wurden mit einem neuen Set aus SSR-Markern durchgeführt, bei denen die orthologen Sequenzen in Arabidopsis thaliana eng mit aussichtsreichen Kandidatengenen für die Glucosinolat-Biosynthese gekoppelt sind. Mittels 62 polymorpher SSR-Primerkombinationen konnten in 94 Genotypen insgesamt 348 Allele amplifiziert werden. Die Assoziationen zwischen Alleldaten und dem Glucosinolatgehalt im Samen wurden mit dem logistic regression Ansatz ermittelt. Insgesamt zeigten sich 29 Primerkombinationen mit dem Gehalt an Glucosinolaten (GSL) als signifikant assoziiert (p≤0.05). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass 4 Gene, die in die Biosynthese von indolischen, aliphatischen und aromatischen Glucosinolaten involviert sind, mit bekannten QTLs für den Glucosinolat-Gehalt in B. napus assoziiert sind. Marker, die mit homoeologen Loci dieser Gene in dem paleopolyploiden Organismus B. napus gekoppelt sind, waren signifikant mit dem Glucosinolat-Gehalt im Samen assoziiert. Mithin sollten Kreuzungen zwischen Genotypen mit hohem bzw. niedrigem Glucosinolat-Gehalt, die gesichert assoziierte komplementäre Markerallele besitzen, in einer transgressiven Segregation resultieren und damit eine Marker-basierte Pyramidisierung von positiven Allelen an relevanten GSL-Loci ermöglichen. Dies eröffnet einen neuen Weg für die Entwicklung von genetisch diversen, heterotischen Pools für die Hybridzüchtung.Insgesamt wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit genomweite SSR-Markerdaten und Informationen über Populationsstrukturen ermittelt, die einen nützlichen Ansatz für weitere strukturbasierte Assoziationsanalysen mit phänotypischen Merkmalen innerhalb des hier genutzten B. napus Coresets darstellen. Weiterhin wurde eine neuartige Herangehensweise entwickelt und erfolgreich angewendet, um durch eine vergleichende Genomanalyse zwischen Brassica und Arabidopsis potentielle, gekoppelte Marker zu identifizieren. In Zukunft kann diese Methode in B. napus und anderen Brassica-Spezies für die Markerentwicklung, für Assoziationsstudien und die markerbasierte Selektion auf zahlreiche Merkmale genutzt werden.