N-Glycanase-1-Mangel – Charakterisierung von Genvarianten

Abstract

N-Glycanase-1-Mangel ist eine kongenitale Störung der Deglykosylierung. Die Krankheit ist durch fünf Kernsymptome geprägt: globale Entwicklungsverzögerung, Choreoathetose, Erhöhung von Leberwerten in Blutuntersuchungen, Hypo-/Alakrimie und eine progressive, sensomotorische Neuropathie. Der Erkrankung liegen Mutationen im Enzym N-Glycanase-1 (NGLY1) zu Grunde. Die N-Glycanase-1 ist vor allem an der ER-assoziierten Degradation von Proteinen beteiligt. Dabei werden N-Glykane vor der proteasomalen Degradation entfernt. Daneben interagiert es unter anderem mit NRF1/NFE2L1 und hat einen Einfluss auf unterschiedliche Signalwege. Bisher sind etwa 56 Mutationen bekannt, die zu der Erkrankung führen. Die Konsequenz jener Mutationen ist ein verminderter Spiegel von N-Glycanase-1 und somit eine verminderte Enzymaktivität. Der genaue Pathomechanismus ist jedoch Gegenstand aktueller Forschung und noch nicht abschließend geklärt. Mögliche Ansätze beziehen sich unter anderem auf eine Verminderung des oben genannten NRF1/NFE2L1 als Transkriptionsfaktor für proteasomale Gene. Diese Arbeit hatte das Ziel, die zwei NGLY1-Varianten, R390Q und R401*, des N-Glycanase-1-Mangels zu charakterisieren. Dafür wurde zunächst eine NGLY1-KO-Zelllinie generiert. Mit dieser wurde dann das Expressionsverhalten der Genvarianten nach transienter Transfektion untersucht. Die Expression von R390Q konnte mit den verwendeten NGLY1-Antikörpern nachgewiesen werden, während dieser Nachweis bei R401* ausblieb. Im Weiteren sollte ein Aktivitätsassay zur Bestimmung der Enzymaktivität von NGLY1 bzw. dessen Genvarianten etabliert werden. Hierzu wurde ein Venuskonstrukt, genannt ddVenus, verwendet, das erst nach Deglykosylierung durch NGLY1 fluoresziert. Damit konnte ein Rückschluss aus der Fluoreszenz auf die NGLY1-Enzymaktivität gezogen werden. Die Ergebnisse zeigten, dass die Enzymaktivität bei beiden Genvarianten hoch signifikant vermindert war. In weiteren Versuchen konnte die Aktivität von R390Q mit Betain nicht gesteigert werden, während bei R401* und der Verwendung von 50 μM Amlexanox mit einer Inkubationszeit von 48 Stunden eine Aktivitätssteigerung festgestellt werden konnte, die jedoch nicht signifikant war. Darüber hinaus wurde aufgezeigt, dass NRF1/NFE2L1 in den KO-Zellen in prozessierter Form akkumuliert. Eine Kompensation durch transiente Transfektion von NGLY1 oder der Genvarianten R390Q oder R401* konnte nicht erreicht werden.