Analyse der biologischen Funktionen von Sirt6 in metabolischen Prozessen

Abstract

Sirtuine umfassen eine hoch konservierte Protein Familie, die eine NAD+-abhängige Deacetylasefunktion und/oder eine ADP-Ribosyltransferaseaktivität aufweisen. In S. cerevisiae und C. elegans konnte gezeigt werden, das Sirtuine die lebensverlängernden Effekte der kalorischen Restriktion vermitteln und dadurch den Prozess des Alterns regulieren. In zahlreichen Studien konnte belegt werden, dass Sirtuine mit vielen Proteinen assoziieren, die in Prozesse involviert sind, die das Leben eines Organismus steuern. Dazu gehören: die Entwicklung, Differenzierung, Seneszenz, Proliferation, sowie die metabolische Regulation. In der vorliegenden Arbeit wurde eine in vitro und in vivo Charakterisierung von Sirt6 durchgeführt, die neue Einblicke in die Funktion von Sirt6 liefern sollte. Der homozygote konstitutive Knock Out von Sirt6 führt in Mäusen zu einem frühzeitigen Tod innerhalb der ersten drei Lebenswochen und erlaubt somit keine Untersuchung der Sirt6 Funktion in adulten Tieren. Durch die Herstellung genetisch veränderter Mäuse, die eine konditionelle Deletion von Sirt6 erlauben, wurde in dieser Arbeit die Voraussetzung zur Analyse der biologischen Funktion von Sirt6 im lebenden adulten Organismus geschaffen. Die zur Kontrolle hergestellte Nullmutation resultierte dabei in demselben Phänotyp, wie er bereits für das konstitutive Knock Out Allel beschrieben ist. Mäuse mit einer leberspezifischen Deletion von Sirt6 zeigten zunächst keine phänotypischen Auffälligkeiten, entwickelten aber mit zunehmendem Alter eine Insulinresistenz und zeigten degenerative Veränderungen in der Leber. Diese Beobachtungen unterstreichen die Funktion von Sirt6 als Regulator metabolischer Prozesse. Neben der Generierung der konditionellen Sirt6 Maus wurde ein SILAC basiertes Screening nach Interaktionspartnern der Sirtuine Sirt1, Sirt6 und Sirt7 durchgeführt. Durch das Screening konnten bereits bekannte sowie viele unbekannte potentielle Bindungspartner identifiziert werden, die zum Teil auch Überlappungen zwischen den Sirtuinen aufwiesen. Durch Co-Immunopräzipitationen konnten einige der möglichen Interaktionspartner von Sirt6 bestätigt werden, darunter auch Glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase 1 (GFAT1). GFAT1 ist das Schlüsselenzym des Hexosamin-Biosyntheseweges (HBW). Das Endprodukt des HBW ist UDP-N-Acetylglucosamin, ein Zuckerrest der reversibel und spezifisch an Serin und Threonin gebunden wird und dadurch die Eigenschaften betroffener Proteine verändert. Der HBW funktioniert als Negativregulator der Insulinsignalkaskade und viele Studien belegen, dass eine erhöhte chronische Aktivität des HBW zur Entstehung von Diabetes beiträgt. In der Leber Sirt6 defizienter Tiere konnte in diesem Zusammenhang eine gesteigerte GFAT1 Aktivität gemessen, sowie eine erhöhte globale Protein-O-Glykosylierung detektiert werden. Die Validierung anderer Bindungspartner von Sirt6 deutet an, dass Sirt6 in Prozesse die die Stabilität und den Abbau von mRNA sowie deren Translation steuern und zudem in die Regulation der Stressantwort involviert ist. Sirtuins comprise a highly conserved family of proteins with either a NAD+-dependent deacetylase- and/or an ADP-ribosyltransferase activity. In S. cerevisiae and C. elegans they mediate the life prolonging effects of caloric restriction and thereby regulate aging in these organisms. It was shown previously that sirtuins associate with a variety of different proteins regulating the organismal lifespan. These proteins are involved in processes regulating development, differentiation, senescence, proliferation as well as metabolic functions. In the present study, one member of the sirtuin family, namely Sirt6, was characterized in vivo and in vitro to obtain new insights into the function of Sirt6. It is known, that homozygous constitutive Sirt6 knockout mice die very early after birth within the first 3 weeks of age thus precluding the characterization of adult animals. Therefore, one aim of this work was to generate a conditional Sirt6 mouse to specifically delete Sirt6 in different tissues of the adult organism. The here generated null Sirt6 mouse strain (after crossing with a CMV-Cre bearing strain) confirmed the already described phenotype of the constitutive Sirt6 knockout. Unexpectedly, no obvious changes could be detected in mice with a liver specific knockout of Sirt6 within the first months of age. However, these mice developed an insulin resistance with age and showed signs of degenerative changes in the liver. These observations support the role of Sirt6 as an important regulator of metabolic processes.In the second part of this work, a SILAC based screening for interacting proteins of the sirtuins 1, 6 and 7 was performed to identify new binding partners. In addition to already known sirtuins interactors several new binding partners could be identified for each of the three sirtuins. Surprisingly, a group of overlapping candidates was common for all investigated sirtuins while another group of proteins suggested interactions specific for each sirtuin. Some of the potential novel interacting partners could be verified by co-immunoprecipitation as for example the glutamine-fructose-6-phosphate amidotransferase 1 (GFAT1) for Sirt6. GFAT1 is the key enzyme of the hexosamine biosynthetic pathway (HBW). The end product of the HBW, UDP-N-acetylglucosamine, is reversibly and specifically bound to serine and threonine residues, thereby regulating the functions and characteristics of the respective proteins. The HBW functions as a negative regulator of the insulin signalling cascade and several studies have shown that a chronic activation of the HBW contributes to the development of diabetes. An elevated activity of the HBW as well as an increased global protein-O-glycosylation could be detected in the liver of the liver specific Sirt6 knockout animals supporting a biological importance of the Sirt6/GFAT1 interaction. Furthermore, validation of other binding partners of Sirt6 suggested a function of Sirt6 in regulating the stability and degradation of mRNAs as well as their translation. Finally, a function of Sirt6 in regulating stress responses was anticipated.