Einfluss von Eimeria bovis auf die Apoptosefähigkeit der Wirtszelle in vitro
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Zusammenfassung
Eimeria bovis-Sporozoiten entwickelt sich in vivo in Endothelzellen und in vitro in mehreren bovinen Zelllinien in einem Zeitraum von 2-3 Wochen zum Meronten I, dem sog. Makromeronten. Dies setzt ein entsprechendes Überleben der Wirtszelle voraus. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des Parasiten auf die Apoptosefähigkeit seiner Wirtszelle in vitro untersucht. Für die Untersuchungen wurden Endothelzellen aus bovinen Umbilikalvenen (BUVEC), eine immortalisierten Zelllinie aus bovinen fetalen Gastrointestinalzellen (BFGC) und Vero-Zellen als Wirtszellen eingesetzt. In allen Fällen wurden geschlossene Zellrasen verwendet. Die Infektion erfolgte mit 2,5 x 104 Sporozoiten/cm2 Zellrasen. Die Befallsrate betrug gewöhnlich 30-40 %. BUVEC und BFGC erlaubten nach Infektion mit Sporozoiten die Entwicklung reifer Meronten mit einer großen Anzahl von Merozoiten innerhalb von 3 Wochen. In infizierten Vero-Zellen kam es nicht zur Weiterentwicklung der Sporozoiten, doch persistierten die Parasiten innerhalb von großen parasitophoren Vakuolen über einen Zeitraum > 3 Wochen. Bei infizierten BUVEC-Zellrasen überlebten infizierte Zellen über einen Beobachtungszeitraum von ca. 21 Tagen bis hin zur Merozoitenfreisetzung. Ab dem 10. Tag p. i. gingen nicht infizierte Zellen in die Apoptose; letztlich war die Mehrzahl dieser Zellen betroffen. Mit zunehmender Dauer der Kultivierung wuchsen aber wieder nicht infizierte Zellen aus, sodass sich zum Teil erneut intakte Zellrasen bildeten. Auch infizierte BFGC und Vero-Zellen überlebten den Untersuchungszeitraum, doch kam es nicht zur spontanen Apoptose nicht infizierter Zellen. In der Folge wurde geprüft, ob E. bovis-Infektionen Wirtszellen auch gegen experimentell gesetzte Apoptosereize schützen. Als Wirtszellen dienten hierbei BFGC und Vero-Zellen. Als Apoptoseinduktoren fanden Actinomycin D, Cytochalasin B und Colchicin Verwendung. In einleitenden Versuchen wurden für die Induktoren die Konzentrationen festgelegt, die bei den Zelllinien etwa 50 % der Zellen apoptotisch werden ließen. Vero-Zellen erwiesen sich als wesentlich resistenter als BFGC. Anschließende lichtmikroskopische Studien und Untersuchungen mittels TUNEL-Assay zeigten, dass eine E. bovis-Infektion spätestens 48 h p. i. die Wirtszelle vor dem Effekt der Apoptoseinduktoren schützt. Diesbezüglich bestand zwischen den Induktoren kein Unterschied. Zu früheren Zeitpunkten p. i. ist keine Aussage möglich, da dann die Applikation der Induktoren von einem Egress der Sporozoiten gefolgt war. Versuche, das Ausmaß der induzierbaren Apoptose anhand der Expression von Annexin V, Caspase 3 oder Cytochrom-c mittels Durchflusszytometrie und Auszählung der Zellen, bzw. Fluoroscan oder ELISA zu bestimmen, schlugen fehl. Offensichtlich waren die erreichbaren Befallsraten in einer Gesamtpopulation von Zellen aus einem Zellrasen zu gering, um entsprechende Unterschiede erfassen zu können. Um die Mechanismen der Apoptoseinhibition durch E. bovis zu erfassen, wurde in konfokalmikroskopischen Studien die Expression der zelleigenen Apoptoseinhibitoren cellular inhibitor of apopoptosis protein1 (c-IAP1), cellular Flice inhibitory protein (c-FLIP) und B-cell-lymphoma-2 (Bcl-2) in infizierten und nicht infizierten BFGC in Reaktion auf Colchicin überprüft. Es zeigte sich, dass unter dem Einfluss des Induktors in infizierten Zellen c-IAP1 und c-FLIP signifikant stärker exprimiert wurden als in nicht infizierten Zellen. Somit wurde der Nachweis erbracht, dass E bovis-Sporozoiten sowohl den rezeptorvermittelten Weg der Apoptose (c-FLIP) beeinflussen können, als auch durch eine verstärkte Expression von c-IAP1 in der Wirtszelle die Caspase 9 und die Effektorcaspase 3 blockieren, um damit zentral in den Ablauf der Apoptose einzugreifen. Im Falle von c-IAP1 betraf die erhöhte Expression auch parasitenfreie Zellen in unmittelbarer Nachbarschaft infizierter Zellen. Hierin wurde ein Hinweis auf parakrine Effekte gesehen. Der Nachweis von Bcl-2 konnte nicht erbracht werden, offensichtlich, weil der zu Verfügung stehende heterologe Antikörper nicht ausreichend kreuzreagierte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass E. bovis die Fähigkeit seiner Wirtszelle zur Apoptose beeinträchtigt und so seine lang andauernde Entwicklung zum Meronten sichert.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2008