Untersuchungen zur Rolle zellulärer Proteine bei der Prozessierung des pestiviralen Nichtstrukturproteins NS2-3 und dessen Bedeutung für Replikation und Virionmorphogenese
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Zusammenfassung
Das positiv-strängige RNA-Genom des Pestivirus bovine viral diarrhea virus (BVDV) wird in ein Polyprotein translatiert, welches ko- und posttranslational durch zelluläre und Virus-kodierte Enzyme prozessiert wird. Eine Cystein-Autoprotease im Nichtstrukturprotein NS2 spaltet NS2-3 und setzt dadurch NS3 frei, welches essentieller Bestandteil des viralen Replikationskomplexes ist. Die Funktion des freien NS3 bei der pestiviralen RNA-Replikation kann nicht von NS2-3 übernommen werden. Letzteres hingegen wird für die Bildung infektiöser Viruspartikel benötigt. Die NS2-3 Spaltung von nicht zytopathogenem (nzp) BVDV ist auf die ersten Stunden nach Infektion beschränkt, so dass zu späteren Zeitpunkten die virale RNA-Replikation herunterreguliert wird und ein Wechsel zur Virionproduktion stattfindet. Demzufolge werden also Replikation und Virionmorphogenese von BVDV durch die Aktivität der NS2 Autoprotease reguliert. Um proteolytisch aktiv zu sein, benötigt die NS2 Protease stöchiometrische Mengen des zellulären Chaperons Jiv (J-domain protein interacting with viral protein) oder seines 90 Aminosäuren großen Fragments Jiv90 als Kofaktor. Der Verbrauch des zellulären Jiv-Vorrats führt zusammen mit der Beschränkung der NS2 Protease auf cis-Spaltung zur zeitlichen Regulation der NS2-3 Spaltung. Aufgrund von Mutationen sind zytopathogene (zp) BVDV Stämme unabhängig von der zellulären Jiv-Menge und spalten NS2-3 während des gesamten Infektionsverlaufs.Zur weiteren Untersuchung der Interaktion von NS2 und Jiv/Jiv90 und der physiologischen Funktion von Jiv in der Zelle wurden rekombinantes NS2 und Jiv-Fragmente in E. coli hergestellt. Um ein ausreichendes Expressionsniveau zu erlangen musste Jiv90 an den C-Terminus von Ubiquitin fusioniert werden. Eine Expression von NS2 war nur als C-terminale Fusion an das B. subtilis Protein Mistic möglich. Es wurden Protokolle zur Aufreinigung löslichen Proteins etabliert. Rekombinantes Jiv90 wurde zur Herstellung eines Jiv-spezifischen monoklonalen Antikörpers genutzt, welcher detailliert charakterisiert und in verschiedenen Assays eingesetzt wurde. Größere Jiv-Fragmente konnten durch Fusion an Trigger Factor und Ubiquitin gewonnen werden.Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Funktion des ungespaltenen NS2-3 bei der Virionmorphogenese. Zu diesem Zweck wurde der zp BVDV Stamm Osloss als Modellvirus gewählt, da er eine Ubiquitin-Insertion zwischen NS2 und NS3 aufweist, die zu einer vermutlich kompletten Spaltung duch zelluläre Ubiquitin-spezifische Proteasen führt. Trotz des anzunehmenden Mangels an unprozessiertem NS2-3 repliziert Osloss zu hohen Virustitern.Chimäre cDNA-Klone, die auf dem nzp Stamm NCP7 basieren und Osloss Genabschnitte unterschiedlicher Größe enthalten, wurden auf die Bildung infektiöser Viren untersucht. Ein NCP7 Genom, das die Osloss Gene NS2 bis NS4A umfasst, führte nach Transfektion zu einem geringen Titer infektiöser Viren. In diesem Kontext konnte eine essentielle Rolle der NS2 Protease bei der Virionmorphogenese ebenso ausgeschlossen werden wie ein Einfluss der Mutation im Osloss-Ubiquitin auf die Virusproduktion. Durch Zellkulturpassage konnte ein chimäres Virus isoliert werden, das ohne im Western Blot nachweisbare Mengen an NS2-3 einen Titer von über 107 Viren/ml erreicht. Eine Konsensus-Sequenz des viralen Genoms offenbarte sieben Nukleotidaustausche, die zu Aminosäureaustauschen führen, und eine Mutation in der 3NTR. Wiedereinfügen der Austausche in den Ausgangs-cDNA-Klon verursachte einen drastischen Anstieg der Bildung infektiöser Viren, wenn eine Mutation in NS2 mit dem 3NTR Austausch kombiniert wurde. Wurden zusätzlich die Mutationen in Erns, E2 und p7 hinzugefügt, führte dies zu einem weiteren Anstieg des Virustiters bis auf das Niveau des Plaque-gereinigten Virus-Stocks.Es konnte also ein chimäres BVD Virus erzeugt werden, welches eigenständig zu hohen Titern repliziert, ohne nachweisbare Mengen ungespaltenen NS2-3 zu exprimieren. Ausserdem konnten Mutationen identifiziert werden, die für die Produktion infektiöser Viren entscheidend sind und welche in weiteren Untersuchungen analysiert werden sollen.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2009