Analyse der mRNA-Expression von Fas und seiner Signaltransduktionskaskade bei Multipler Sklerose und Experimenteller Autoimmuner Enzephalomyelitis

Abstract

Hintergrund: Bei Patienten mit schubförmiger Multipler Sklerose (RR-MS) wurden in Leukozyten fluktuierende Fas-Expressionen während des Krankheitsverlaufs gemessen. Fas ist ein an der Regulation einer chronischen Immunantwort beteiligter Rezeptor, der durch Bindung der Fas-assoziierten Death Domain (FADD) und Spaltung von Caspase 8 den Zelltod auslösen kann. Bindet er cellular FLICE-like inhibitory protein (cFlip) anstelle von Caspase 8, werden proliferationsfördernde Signalwege aktiviert. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Charakterisierung der mRNA-Expression von Fas, FADD, cFlip und Caspase 8 in Leukozyten des peripheren Bluts von MS-Patienten sowie in Leukozyten der Milz und des Zentralen Nervernsystem (ZNS) bei Mäusen mit Experimenteller Autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE). Design/Methode: Die Quantifizierung der mRNA-Level erfolgte mittels SYBR-Green Real Time-PCR. Es wurde eine Gruppe aus untherapierten RR-MS Patienten im Schub und drei Monate (Remission) danach untersucht und mit einer untherapierten Baselinegruppe ohne klinische Aktivität sowie gesunden Kontrollen verglichen. C57Bl/6 Mäuse wurde mit MOG35-55 zur Induktion der EAE immunisiert und an Tag 8, 16 und 24 des Krankheitsverlaufs getötet. Ergebnisse: Bei den MS-Patienten fand sich abhängig vom Verlauf eine verminderte mRNA-Expression von Fas und Caspase 8, die negativ mit dem Behinderungsgrad der Patienten korrelierte. FADD war bei allen MS-Patienten im Vergleich mit den gesunden Kontrollen erhöht. Es zeigte sich keine signifikante Veränderung der cFlip mRNA-Expression zwischen den verschiedenen Gruppen. Bei EAE fanden sich keine Veränderungen der Transkriptlevel von Fas in der Milz, in den Leukozyten des ZNS war Fas jedoch an Tag 24 signifikant erhöht. Die FADD mRNA-Expression war in der Milz im Vergleich mit den gesunden Kontrolltieren erhöht, in den zerebralen Leukozyten im Vergleich mit der Milz jedoch erniedrigt. Es zeigten sich keine Veränderungen der cFlip mRNA-Expressionslevel in der Milz, in den Leukozyten des Gehirns waren die Transkripte jedoch an Tag 8 und 16 erhöht. Caspase 8 war in der Milz im Vergleich zu den gesunden Kontrollen erniedrigt, stieg in den Leukozyten des ZNS jedoch an Tag 16 und 24 an. Diskussion: Bei MS zeigten sich erniedrigte mRNA-Expressionslevel von Fas und Caspase 8, zweier wichtiger Marker des programmierten Zelltodes. Beide korrelierten negativ mit dem Behinderungsgrad der Patienten. Die niedrige mRNA-Expression mag zu einer verminderten Apoptosefähigkeit in den Leukozyten beitragen und somit die Immunreaktion verlängern. Der deutliche Anstieg der Transkripte von Fas und Caspase 8 bei EAE in der Remission im ZNS könnte durch erhöhte Proteinlevel und damit verbesserte Apoptosekapazitäten zur Beendigung der Immunantwort beitragen.

Background: Recent studies showed that Fas expression in leukocytes differs during the course of disease in Multiple Sclerosis (MS). Fas can regulate a chronic immune response by inducing apoptosis through FADD and Caspase 8. Binding of cFlip instead of Caspase 8 changes the signalling towards survival. Our objective was to characterize the mRNA-expression levels of Fas, FADD, Caspase 8 and cFlip in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in relapsing-remitting (RR-) MS and leukocytes from the spleen and the Central Nervous System (CNS) in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE). Design/Methods: mRNA levels were quantified in leukocytes using SYBR-Green Real-Time PCR. RR-MS patients were studied in relapse and 3 month after relapse (remission) and compared to a baseline group with no clinical activity and healthy controls (HC). None of the patients were on immunomodulatory therapy. C57Bl/6 mice were immuniced with MOG35-55 to induce EAE and were killed during the course of disease at day 8, 16 and 24. Results: In MS, Fas and Caspase 8 mRNA expressions were decreased during the course of disease and showed a negative correlation with the severity of symptoms. The transcripts of FADD were increase in all patients groups. There was no significant change in cFlip mRNA expression in MS. In EAE, the transcripts of Fas did not differ within the spleen, but were increased in cerebral leukoytes at day 24. FADD mRNA expressions were increased in the spleen in comparison to the control animals, but were decreased in the leukocytes from the CNS. There was no significant change in cFlip mRNA expression in the spleen, but cerebal leukocytes showed an increase of cFlip transcripts at day 8 and 16. The transcripts of Caspase 8 were decreased in leukocytes from the spleen in comparison to healthy control animals, and were increased at day 16 and 24 in the CNS. Conclusions: In MS a decrease in the mRNA-levels of Fas and Caspase 8 is seen. Both transcripts correlate negatively with the severity of symptoms. Thus the transcripts of the proteins are decreased that are known to regulate a chronic immune response through apoptosis and might prolong disease activity. In EAE, Fas and cFlip mRNA expressions in the spleen did not change significantly, while Caspase 8 is decreased and FADD is up regulated. In the CNS, Fas, FADD and Caspase 8 are increased at day 24. Therefor the transcripts of the proteins are increased that can induce apoptosis and thus might contribute to the termination of the immunresponse in autoreaktive leukocytes in the CNS.