Polymorphismen in den Cytochrom-P450-Enzymen des Hundes

Abstract

Die vorliegende Arbeit stellt einen aktuellen, zusammenfassenden Überblick über die Polymorphismen in den Cytochrom-P450-Enzymen des Hundes dar. Es wurde dabei nicht, wie bei vorangegangenen Studien, eine einheitliche Beagle-Population untersucht. Vielmehr stellte die Testgruppe je nach spezifischer Fragestellung ein Patientengut von mindestens 20 verschiedenen Hunden unterschiedlicher Rassen dar, welche als Patienten in der Klinik für Kleintiere der JLU Gießen vorgestellt wurden. Das genetische Material dieser Hunde wurde aus Lebergewebe gewonnen und mittels verschiedener molekularbiologischer Methoden (PCR, real-time PCR und Sequenzierung) auf Variationen in den Sequenzen und im Expressionsniveau der Cytochrom-P450-Enzyme 1A2, 2B11, 2C21, 2C41, 2D15 und 3A12 untersucht. Einige dabei gefundene Polymorphismen wurden bereits in der Literatur erwähnt, z.B. der Gendeletions-Polymorphismus im CYP2C41-Gen (Blaisdell et al. 1998). Es konnte festgestellt werden, dass aus einer Gruppe von 441 Hunden verschiedener Rassen nur bei 14,74 % das CYP2C41-Gen nachgewiesen werden konnte. Des Weiteren wurden erstmals die Exon-Intron-Grenzen des CYP2C41-Gen des Hundes bestimmt, seine komplette genomische Sequenz ermittelt und diese in der GenBank-Sequenzdatenbank hinterlegt. Auffällig war die Tatsache, dass alle auf das Vorhandensein des CYP2C41-Gens getesteten Hunde der beiden Rassen Husky und Shar Pei das Gen tatsächlich aufwiesen, was sich durch den Umstand erklären könnte, dass beide Rassen genetisch gesehen recht urtümlich sind und eine nahe Verwandtschaft zum Wolf aufweisen. Das CYP2C41-Gen scheint dann im Laufe der Zeit in den meisten Rassen mehr oder weniger aus dem Genom verschwunden zu sein. Zur Evaluation der eventuellen klinischen Relevanz und um eine evolutionsbiologische Erklärung des Gendeletions-Polymorphismus zu erlangen, wären anschließende funktionelle Tests sinnvoll. In allen anderen fünf untersuchten CYPs konnten teils einzelne (CYP2C21), teils eine große Zahl (CYP2D15) an Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) entdeckt werden. Die meisten dieser SNPs stellten sich als stille Mutationen dar, bei denen mit keiner negativen Beeinflussung der CYP-Enzymfunktion zu rechnen ist. Einzelne SNPs wurden bioinformatisch mittels SIFT, einem Programm, das unterscheidet, ob ein Aminosäureaustausch (ASA) im korrespondierenden Protein für dessen Funktion tolerierbar ist oder nicht, als nicht-tolerierbar bewertet. Da diese Bewertung aber nur einen vagen Anhaltspunkt für die mögliche funktionelle Relevanz gibt, müssen auch hier weitere funktionelle Untersuchungen folgen. Diese sollen klären, ob diese SNPs tatsächlich eine Auswirkung auf die Funktion dieser CYPs im Arzneistoffmetabolismus haben. Zusätzlich zu den diversen SNPs welche im CYP2D15-Gen zu finden waren, konnte in vorliegender Arbeit auch die bereits 1998 von Roussel et al. beschriebene in frame Deletion von Exon 3 (delta Exon3) dargestellt werden. In einer full-length-PCR des CYP2D15 wiesen sich 35 % der getesteten Hunde als Träger des Exons 3 Polymorphismus aus. Ebenso viele Hunde waren nicht vom Polymorphismus betroffen, wohingegen 30 % der Hunde heterozygote Träger dieses Merkmales waren. Eine klinische Relevanz ist hier anzunehmen, da bereits ein Zusammenhang zwischen dem Polymorphismus und einer verminderten Metabolisierungsrate von Celecoxib beschrieben wurde (Paulson et al. 1999). Jedoch ist es wahrscheinlich, dass das Fehlen von Exon 3 kein absolutes Ereignis ist, sondern dass es sich um einen Exon skipping Polymorphismus handelt. Auch die Expression auf mRNA-Ebene wies zwischen den unterschiedlichen Cytochromen, zwischen einzelnen Tieren und auch individuell eine große Varianz auf. So variierte z.B. das Ergebnis der real-time PCR von CYP1A2 um bis zu 12 Ct -Werte. Diese große Spannbreite könnte auf eine unterschiedliche Geninduktion der CYPs in der Leber in dem sehr heterogenen Patientengut zurückzuführen sein.Diese Resultate machen deutlich, dass veterinärmedizinische Patienten oder präklinische Versuchstiere genetisch nicht identisch sind. Aufgrund ihrer individuell sehr unterschiedlichen Ausstattung von zum Teil sehr polymorphen CYPs in der Leber, sollten sie eigentlich individuell behandelt werden. Dies ist jedoch bisher nicht etabliert. Mit den Erkenntnissen der vorliegenden Arbeit ist auf diesem Hintergrund ein weiterer Schritt gelungen, um das individuelle Ansprechen und die individuell sehr unterschiedliche Verträglichkeit einer Arzneitherapie auf molekularer Ebene besser erklären zu können. The thesis presents current, summarized findings about polymorphisms of cytochrome-P450-enzymes in dogs. In comparison to previous studies, it was not tested among a homogeneous collective of Beagle dogs. Instead, the test-group was a cohort of at least 20 different dogs, of different breeds, which all were patients of the JLU Gießen, Klinik für Kleintiere .The genetic material was extracted out from liver tissue samples and scanned by different methods of molecular biology (e.g. PCR, real-time PCR and sequencing) for variations in sequence and level of expression in the cytochrome-P450-enzymes 1A2, 2B11, 2C21, 2C41, 2D15, and 3A12.Some detected polymorphisms have already been mentioned in former literature, as the gene deletion polymorphism in the CYP2C41 gene (Blaisdell et al. 1998). Results show, that in a group of 441 individual dogs of different breeds, only 14,75 % possessed the CYP2C41 gene. Furthermore, for the first time the exon-intron-boundaries and the genome sequence of this CYP2C41 gene of the dog were identified and the complete sequence was entered in gene bank. Noticeable was the fact, that all dogs, belonging to the breeds Husky and Shar Pei, tested for the existence of the CYP2C41 gene, possessed this gene. An explanation might be, that both breeds are ethnic and phylogenetically old, with a still near relationship to the ancestor wolf. It seems that in course of time the CYP2C41 gene has disappeared of the canine genome in most of dog breeds. Further functional tests are necessary to evaluate possible clinical relevance and to get an evolutionary and biologically explanation for the gene deletion polymorphism. In all other examined CYPs, sporadic (CYP2C21), or large numbers (CYP2D15) of single nucleotide polymorphisms (SNPs) were found. Most of these SNPs represent a silent mutation, without an expected negative impact on the CYP enzyme function. Several SNPs were rated by SIFT, a program sorting by bioinformatics, if an amino acid change in the correlated protein is relevant for enzyme function or not, as not-tolerable. Because of the reason, that this rating is only an uncertain lead, there is a need for further functional testings. They should clear, if these SNPs really have an effect on the CYP metabolism of drugs. In addition to the diverse different SNPs in the CYP2C15 gene, there was also found (already described by Roussel et al. 1998) the in frame deletion of exon 3 (delta exon3). In a full-length-PCR of CYP2D15, 35 % of the tested dogs were identified as an owner of the exon 3 polymorphism. An identical percentage rate of dogs was not affected by this polymorphism and 30 % of them were heterozygous owner of this attribute. A clinical relevance is suspected, because of a correlation between the polymorphism and a reduced metabolism rate of Celecoxib (Paulson et al. 1999). However it is probable, that the missing of exon 3 is not an absolute event, but an exon skipping polymorphism. The mRNA expression also showed a huge variation between the different cytochromes and canines: E.g. the result of the real-time PCR of CYP1A2 varied up to around 12 Ct -values. This high range could indicate to a different gene induction of CYPs in liver of the very heterogeneous patient population.All these results clearly show, that both, veterinary patient or preclinical laboratory animal, are genetically not identical. Because of their unequal endowment of partly very polymorphic CYPs in the liver, they rather should be medicated individually. Until now, this is not established yet. Based on the results of the presented thesis, an additional step on that background is succeeded to better interpret the individual response and the different tolerance of drug therapie on the molecular level.