Untersuchungen zur Proteinbiosyntheseaktivität humaner Thrombozyten
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Thrombozyten werden auch Blutplättchen genannt und sind die kleinsten zellulären, kernlosen Bestandteile des Blutes. Neben ihrer Hauptfunktion bei der primären und sekundären Hämostase haben sie entscheidenden Einfluss auf die sich anschließende Wundheilung. Infolge einer Gefäßverletzung entsteht im Zusammenspiel von Thrombozytenaggregation und Gerinnungskaskade ein Thrombus, um einen möglichst raschen Gefäßverschluss zu erzielen; dabei erfolgt die Aktivierung und Aggregation der Thrombozyten. Durch die Ausbildung von Pseudopodien vergrößern sie ihre Oberfläche zur Präsentation von Zelladhäsionsrezeptoren. Des Weiteren kommt es im Rahmen der Aktivierung zur Degranulation, d.h. zur Freisetzung der Mediatoren aus den Speichergranula. Auch bei den während der Gefäßverletzung initiierten Prozessen der akuten Inflammation mit dem Ziel einer unspezifischen Immunabwehr, sowie der Gefäß- bzw. Geweberegeneration, übernehmen Thrombozyten wichtige Aufgaben: Die während der Aktivierung freigesetzten Mediatoren haben nachweislich chemotaktische, mitogene und auch antibakterielle Wirkungen. So werden inflammatorische Effektorzellen in das geschädigte Gewebe gelockt und durch Zelladhäsionsrezeptoren an der Thrombozytenoberfläche immobilisiert. Bis jetzt noch ungeklärt ist, ob Thrombozyten darüber hinaus Wachstumsmediatoren bzw. Mediatoren generell durch de novo Proteinsynthese zum Erhalt langfristiger Wirkungen bereitstellen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Aspekt der de novo Proteinbiosynthese in Thrombozyten näher untersucht. Dazu wurden zwei verschiedene Verfahren des Nachweises einer Proteinsynthese gewählt: Die radioaktive Proteinmarkierung und Proteingelanalyse dienen dem allgemeinen Nachweis neu gebildeter Proteine. Hierzu wurden leukozytendepletierte Thrombozyten in Anwesenheit einer radioaktiv markierten Aminosäure (35S-Methionin) mit und ohne Agonist (Thrombin oder ADP) inkubiert. Den Vergleichsansätzen wurden autologe Leukozyten hinzugefügt. Mittels 1D- bzw. 2D-Gelelektrophorese erfolgte die Auftrennung der Proteinextrakte aus den Ansätzen. Durch eine im Anschluß folgende Autoradiographie konnten die radioaktiv markierten, aus der de novo Proteinbiosynthese entstandenen Proteine sichtbar gemacht werden. Positive Ergebnisse im Sinne eines radioaktiven Proteins konnten bei diesen Untersuchungen nur dann erzielt werden, wenn eine Kontamination durch Leukozyten vorlag. Der spezifische Nachweis von Wachstumsfaktoren, die für die Wundheilung relevant sind (IL-1ß, pro IL-1ß und VEGF), erfolgte mittels ELISA. Dazu wurden die Thrombozytenpräparate mit und ohne Kontamination durch Leukozyten mittels Thrombin bzw. ADP stimuliert und anschließend noch 17-20h in Zellkulturmedium inkubiert. Die Messungen der Proteinkonzentrationen erfolgten vor und nach Inkubation. Des Weiteren wurde einem Vergleichsansatz Puromycin als Translationshemmer beigefügt. Auch dieser spezifische und quantitative Ansatz zum Nachweis von de novo Proteinsynthese führte nur dann zum positiven Ergebnis (= Anstieg der Proteinkonzentration), wenn eine Kontamination mit Leukozyten vorlag. Aus den Daten der vorliegenden Arbeit ist eine de novo Proteinbiosynthese und damit die nachhaltige Bereitstellung von Mediatoren durch aktivierte Thrombozyten über die einmalige Freisetzung hinaus unwahrscheinlich. Der Widerspruch zu der in der Fachliteratur beschriebenen Proteinbiosynthese in Thrombozyten könnte durch die unterschiedlichen Präparations- und Aufreinigungsverfahren begründet sein. Das Ausmaß der Leukozytenkontamination scheint hierbei einen entscheidenden Faktor darzustellen.Link to publications or other datasets
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Giessen : VVB Laufersweiler 2008