Ziel dieser Arbeit war es die protektive Wirkung,sowie die dazugehörigen Wirkungsmechanismen von Cyclosporin A (CsA)an einemLangzeitischämie-Modell beim Hund zu untersuchen.Hierzu wurden zwölf Spenderherzen während einer 18stündigen globalen Ischämieunter hypothermen Bedingungen mit 'University of Wisconsin '(UW)-Lösung perfundiert und anschließend 6 Stunden von einemEmpfängertier reperfundiert.Dabei wurden sechs Herzen mit CsA (10 -5 mol/l) behandelt,während die unbehandelten Organe als Kontrolledienten.Die vor (A) und nach (B)der Ischämie sowie nach zwei (C)bzw.sechs (D)Stunden Reperfusion entnommenen Biopsien wurdenanschließend histologisch untersucht.
Außerdem wurden im Verlauf der Reperfusionsphase stündlich Funktionsparameter bestimmt,deren Auswertung die protektive Wirkungvon CsA zeigte. Während sich die kontraktile Funktion in der behandelten Gruppe vollständig erholte,erreichte die endsystolischeElastizität der unbehandelten Herzen nur 50% der Kontrollwerte.
Im zweiten Teil der Studie sollten die möglichen Ursachen für die protektiven Effekte von CsA erforscht werden,wobei sich folgendeResultate ergaben:
Im Elektronenmikrokop zeigten die meisten Präparate nach der 18stündigen Ischämie eine reversible Schädigung.Allerdings war derSchädigungsgrad in den mit CsA perfundierten Herzen weitaus geringer.
Weiterhin wurde in keinem der Präparate elektronenmikroskopische Anzeichen nekrotischer Zellen gefunden.Dafür spricht auch diefehlende Markierung nach der Complement C9 Färbung.
Im Gegensatz dazu stieg der mittels TUNEL-Methode bestimmte Anteil an apoptotischen Zellen zum Ende der Reperfusion signifikant auf5,9%in der unbehandelten Gruppe.Diese Apoptoserate wurde durch die Gabe von CsA um mehr als 50%auf 2,4%gesenkt.Im weiterenVerlauf wurden die Ergebnisse der TUNEL-Methode durch die Resultate der Lamin B1-Färbung bestätigt.Während die Reduktion vonLamin B1-positiven Kernen in der D-Biopsie der CsA-freien Gruppe 93%betrug,fiel der Anteil in der CsA-Gruppe auf 97%.Die gleicheTendenz ergab sich aus der Lamin A-Färbung,wobei der Anteil an negativen Kernen nach 6stündiger Reperfusion bei 27%(ohneCsA)bzw.5%(mit CsA)lag.
Um die genauen Mechanismen der Protektion zu erforschen,wurden verschiedene Proteine mittels der Western Blot-Technikausgewertet.Dabei ergab insbesondere die quantitative Auswertung des mitochondrialen Cytochrom C-Gehaltes zum Ende der Ischämieeinen signifikanten Unterschied.Während das partikuläre Cyto- chrom C in den mit CsA perfundierten Herzen nur auf 73%derAusgangsmenge fiel,verringerte sich der Gehalt ohne CsA auf 48%.Dagegen reduzierte sich derGehalt an Bax-Protein erst nach 6Stunden Reperfusion auf 65%(ohne CsA)bzw. 71%(mit CsA).Gleiches galt für das Bcl-2-Protein,wobei die Gesamtmenge nach derIschämie leicht anstieg,bevor der Gehalt zum Ende der Reperfusion auf 70% ohne und 81%mit CsA abfiel.
Entsprechend verringerte sich die Gesamtmenge an Calcineurin nach 6stündiger Reperfusion auf 64%(ohne CsA)bzw.72%(mit CsA)derAusgangsmenge. Allerdings führte die Perfusion der Herzen mit CsA zu einer vollständigen Hemmung der Calcineurinaktivität während derIschämie und der Reperfusion, während die Enzymaktivität ohne die Behandlung mit CsA erst nach 6 Stunden Reperfusion auf 70%derAusgangsaktivität fiel.
In Bezug auf alpha-Aktinin und Aktin konnten im Western Blot keine Mengen- unterschiede zwischen den einzelnen Zeitpunkten festgestelltwerden.Hingegen zeigte die immunhistochemische alpha-Aktinin-Markierung in den C-und D- Biopsien beider Gruppen offensichtlicheVeränderungen,die sich als Areale mit aufgelöster und diffuser Querstreifung darstellten.
Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse eine deutliche protektive Wirkung von CsA,die in Kombination mit Hypothermie undUW-Lösung zu einer drastischen Verbesserung der funktionellen und strukturellen Erholung nach Langzeitischämie und Reperfusion führt.
Dabei verringert CsA einerseits die in der CsA-freien Gruppe auftretenden ischämischen Beschädigungen,andererseits reduziert CsAsignifikant die im Verlauf der Ischämie eingeleitete Apoptose.
Beide Effekte werden maßgeblich durch die CsA-bedingte Hemmung der Ca 2+ - abhängigen mitochondrialen 'permeability transition'-Pore verursacht.Dadurch verhindert CsA die Schwellung der Mitochondrien und die Freisetzung des Apoptoseinduktors CytochromC.Außerdem blockiert CsA die pro-apoptotische Wirkung von Calcineurin durch die vollständige Enzymdeaktivierung.
Als CsA-unabhängig erwiesen sich die Proteine der Bcl-2-Familie.In beiden Versuchsgruppen änderte sich das Konzentrationsverhältniszwischen den pro-und anti-apoptotischen Mitgliedern der Familie zugunsten des anti-apoptotischen Bcl 2 s.Hieraus resultiert vermutlichdie geringe Apoptoserate trotz der 18stündigen Ischämie.
Insgesamt deuten die Ergebnisse auf eine herausragende Rolle von CsA bei der Entwicklung neuer kardioplegischer Lösungen für dieHerzaufbewahrung bei humanen Transplantationen hin,wobei neben der Vergrößerung des Donorpools vor allem die schnellere Erholungdes Organs von Bedeutung wäre.
Inwiefern andere Mechanismen (z.B.IAP oder NO)an der Verbesserung der Ischämietoleranz beteiligt sind,muss in zukünftigen Versuchenuntersucht werden.
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