On Slide Selektion auf Formalin-fixiertem und in Paraffin-eingebettetem (FFPE) Patientengewebe zur Generierung spezifischer Antikörper mittels Phage Display Technologie

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2015

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10342

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Monoklonale Antikörper nehmen in der Diagnose und zielgerichteten Therapie von malignen Erkrankungen eine immer wichtigere Rolle ein. Die erfolgreichste in vitro Methode zur Generierung neuer, monoklonaler Antikörper ist die Phage Display Technologie. Hierbei werden aus einem Pool von an Bakteriophagen gekoppelten Antikörpern Antigen-spezifische Antikörper selektioniert. Beim Standardselektionsverfahren werden rekombinante Proteine, Antigen-transfizierte Zellen oder Tumorzelllinien als Zielantigene verwendet. Diese Antigene können sich jedoch von der natürlichen Form der Antigene in den Tumoren der Patienten unterscheiden, wodurch es zur Selektion von klinisch irrelevanten Antikörpern kommen kann. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Antikörperselektionsstrategie auf Formalin-fixiertem und in Paraffin-eingebettetem (FFPE) Patienten Routinematerial mit komplexen Antigenstrukturen etabliert. FFPE Biopsien erhalten größtenteils ihre tumorspezifischen Charakteristika, weshalb sie als ein vielversprechendes Ausgangsmaterial für die Selektion krankheitsrelevanter Antikörper erscheinen. Da es sich bei dem verwendeten Patientenmaterial um Routinebiopsate handelt, entsteht keine zusätzliche Belastung für den Patienten. Außerdem ist im Vergleich zum Standardselektionsverfahren keine aufwendige Herstellung, Aufreinigung, Lagerung oder Kultivierung des Ausgangsmaterials notwendig.Die Etablierung der Methode erfolgte auf immobilisierten Gewebeschnitten von vier verschiedenen Patientenbiopsaten mit kleinzelligem Bronchialkarzinom (SCLC). Die kommerziellen, humanen scFv Antikörperbibliotheken Tomlinson I und J wurden zunächst auf gesundem Lungengewebe depletiert, um so tumorirrelevante Antikörper zu entfernen. Anschließend erfolgte die Selektion auf SCLC-Gewebeschnitten. Zur Erhöhung der Epitopzugänglichkeit wurden vor der Depletion und Selektion verschiedene Antigendemaskierungsverfahren angewendet. Hierdurch konnte eine Serie von neuen Antikörpern selektioniert werden, deren Tumorspezifität in vitro im ELISA und in der Durchflusszytometrie auf den SCLC Zelllinien NCI-H69, NCI-H82 und DMS 273 verifiziert werden konnte. Bei der näheren Charakterisierung von drei der selektionierten Antikörper konnte zusätzlich die spezifische Bindung ex vivo auf Tissue Microarrays mit 35 verschiedenen SCLC Biopsien im Vergleich zu 20 verschiedenen gesunden Organen bestätigt werden. Nach Analyse des Internalisierungsverhaltens der drei scFv s, wurden diese zur Herstellung von rekombinanten Immuntoxinen an eine verkürzte Form des Pseudomonas Exotoxins A (ETA´) fusioniert. Das zytotoxische Potenzial von zwei der drei rekombinanten Immuntoxine konnte durch Zellviabilitäts- (XTT) und Apoptose-Assays (Annexin V) verifiziert werden, wobei die mittlere inhibitorische Dosis (IC50) im unteren nanomolaren Bereich lag. Somit konnte ein möglicher diagnostischer und therapeutischer Einsatz der selektionierten Antikörper bestätigt werden.Bei der On Slide Selektion handelt es sich um die erste, Phage Display basierte Antikörperselektion direkt auf Patienten FFPE Routinematerial, welches auf Glasobjektträgern immobilisiert wurde und dessen komplexe Antigenstrukturen durch verschiedene Demaskierungsverfahren freigelegt wurden.

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