Die gezielte Veränderung des genetischen Erbmaterials eröffnet u.a. die Möglichkeit Funktionen bestimmter Gene zu erforschen, ökonomisch wichtige Kulturpflanzen ertragreicher zu machen und ist vor allem auf dem gentherapeutischen Forschungsgebiet in den Fokus gerückt, da es einen enorm wichtigen Fortschritt in der Therapie gewisser Erbkrankheiten bedeuten könnte. Eine methodische Genom-Modifikation kann mit hochspezifischen Nukleasen erreicht werden, die eine singuläre Zielsequenz im Genom spalten. Je nach eingesetzter Nuklease können Doppel- oder Einzelstrangbrüche eingeführt werden. Die Reparatur des DNA-Schadens kann über homologe Rekombination (HR) in Anwesenheit einer homologen DNA-Reparatur-Matrix erfolgen oder alternativ, wenn eine DNA-Reparatur-Matrix fehlt oder nicht genutzt wird, kann ein Doppelstrangbruch den Reparaturmechanismus des non-homologous end-joining (NHEJ) stimulieren. NHEJ führt jedoch gewöhnlich zu Insertion und Deletion an der DNA-Bruchstelle, weshalb die Reparatur fehlerbehaftet ist. Daher wird dieser Ansatz für die gezielte Inaktivierung von Genen genutzt. Für Anwendung wie z.B. Gen-Korrektur oder Gen Insertion, können hingegen Nickasen herangezogen werden, die die HR stimulieren, NHEJ aber effektiv vermeiden und daher das Risiko für unerwünschte Mutationen senken. Im Rahmen dieser Arbeit werden drei innovative hochspezifische Nukleasen generiert und charakterisiert, die auf den DNA-Spaltungsmodulen MutH und HinP1I basieren. MutH und HinP1I sind monomere Endonukleasen, infolgedessen stellen die Fusionskonstrukte funktionale Monomere dar. Im Gegensatz zu dem häufig genutzten DNA-Spaltungsmodul FokI, sind MutH und HinP1I sequenzspezifisch für eine vier Basenpaare lange Erkennungssequenz, somit können zytotoxische Effekte durch unspezifisches Spalten der DNA weiter reduziert werden. Für eine sichere Anwendung ist zusätzlich die Funktion der DNA-Spaltungsmodule streng mit der Funktion des DNA-Bindungsmoduls gekoppelt, da die Nukleaseaktivität von Natur aus schwach ist, wie im Fall von MutH, bzw. bei HinP1I durch gezielte Mutationen vermindert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Fusion der katalytisch inaktiven Variante I-SceI bzw. der DNA-Bindungsdomäne des TALE-Proteins AvrBs4 an MutH eine hochspezifische Nickase generiert werden konnte, die eine adressierte Zielsequenz 1000-mal schneller spatete als eine unspezifischen Sequenz und keinerlei toxischen Effekte in E. coli hat. Darüber hinaus weist das Fusionskonstrukt TALE-MutH eine Strangpräferenz auf, die abhängig von dem Basenpaarabstand zwischen TALE- und MutH-Erkennungssequenz ist und daher steuerbar ist. Mit der Fusion der DNA-Bindungsdomäne des TALE-Proteins AvrBs3 und einer abgeschwächten Variante von HinP1I entsteht eine monomere hochspezifische Nuklease, die sowohl einen Doppelstrang-, als auch einen Einzelstrangbruch prozessieren kann. Hierbei ist ebenfalls der Abstand zwischen den Erkennungssequenz ausschlaggebend für den Spaltmechanismus. Dabei wird die adressierte Zielsequenz im Vergleich zu unspezifischen Sequenzen deutlich präferiert. Folglich wurden in dieser Arbeit zwei hochspezifische Nukleasen entwickelt, die für jede Art der Anwendung genutzt werden können, um komplexe Genome gezielt zu modifizieren.
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