Bedeutung der Glykosylierung für die Pathogenese der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien
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Zusammenfassung
Ziel der Arbeit war es, die Bedeutung der Glykosylierung des Prionproteins für die Pathogenese der Scrapie-Erkrankung zu untersuchen. Obwohl nach dem derzeitigen Wissensstand ein fehlgefaltetes Protein (PrPSc) die Krankheit verursacht, können bei der Scrapie-Erkrankung verschiedene Stämme unterschieden werden. Zuckerseitenketten des Prionproteins werden als eine mögliche Ursache dieser Stammvielfalt diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit sollten deshalb verschiedene transgene Mäuse hergestellt werden, die un- bzw. monoglykosyliertes Mausprionprotein exprimieren. Frühere Arbeiten zeigten, dass die Deletion der ersten Erkennungssequenz für N-Glykosylierung durch den Austausch von Threonin zu Alanin an Kodon 182 des Maus-Prionproteins zu einer gestörten PrPsen-Synthese mit behinderter Oberflächenexpression führt. Ebenso waren transgene Mäuse mit dieser Mutation resistent gegenüber einer Scrapie-Infektion mit zwei verschiedenen Stämmen. Die Zerstörung der zweiten Glykosylierungsstelle beeinträchtigte indes weder Trafficking noch die grundsätzliche Scrapie-Infizierbarkeit. Da es in der Literatur Hinweise gab, dass PrPsen auf der Zelloberfläche exprimiert werden muss, damit PrPres Zellen infizieren kann, stellte sich die Aufgabe transgene Tiere herzustellen, deren glykosylierungsmutiertes PrP möglichst authentisch prozessiert wird, um so eine wichtige Grundvoraussetzung für die Infizierbarkeit der Mäuse zu schaffen. Aus diesem Grund wurden verschiedene Erkennungssequenz-mutierte PrP-Moleküle in Zellkultur charakterisiert. Dazu wurden über 20 verschiedene PrPsen-Mutanten kloniert, sequenziert und anschließend in verschiedenen Zelllinien mit immunologischen und biochemischen Methoden untersucht. Mittels Oberflächenbiotinylierung, Immunfluoreszenz, Endo H-Verdau und Durchflusszytometrie wurde die Zell-Topologie der PrP-Mutanten ermittelt. Im Westernblotverfahren in Verbindung mit PNGase F-Verdau wurde der Glykosylierungszustand der Moleküle untersucht. Die Verankerungsform der Moleküle wurde mittels PIPLC-Verdau, das Vorhandensein von Schwefelbrücken in einem weiteren proteinbiochemischen Verfahren untersucht. Über Ultrazentrifugation wurde die Löslichkeit der Moleküle bestimmt. Nach der Charakterisierung von PrPsen wurden verschiedene ausgewählte Mutanten in scrapieinfizierten Zellen (ScN2a) auf Umfaltbarkeit in ihre Proteinase K-resistente Isoform PrPres untersucht. Zu diesem Zweck wurden ScN2a Zellen mittels eines retroviralen Systems transduziert und Zellhomogenate direkt bzw. nach Proteinase K-Verdau und Ultrazentrifugation im Westernblot untersucht. Dabei zeigte sich, dass prinzipiell jede der sechs untersuchten Mutanten (Wt3F4, T182A, T182N, T198A, T182A/T198A, T182N/T198A) konvertierbar war. Die unglykosylierte Mutante T182N/T198A zeigte jedoch einen dominant-negativen Effekt, d.h. eine Umfaltung war nur möglich, wenn dieses Konstrukt in geringen Mengen in der Zelle exprimiert wurde. In Anwesenheit von vielen mutierten PrPsen-Molekülen konnte keine Konversion dieser Mutante detektiert werden, während gleichzeitig die nachweisbare Menge an endogenem Maus- PrPres abnahm. Dieser Effekt wurde bis dato noch nicht im Zusammenhang mit Mutationen in diesem Bereich des Prionproteins beschrieben. Bei dem Versuch Maus-Neuroblastomzellen (N2a), welche mutiertes PrPsen exprimieren, mit drei verschiedenen TSE-Stämmen (Me7, Chandler und 79A) zu infizieren, war nur der Stamm Me7 in der Lage 3F4-getaggtes Prionprotein umzufalten. Unter den gewählten Versuchsbedingungen wurden nur die Mutanten umgefaltet, die vergleichbar mit Wildtyp 3F4 auf der Zelloberfläche detektiert werden konnten (T182N, T198A, T182N/T198A). Demnach bestätigte sich, dass für eine de novo Scrapie-Infektion einer Zelle das umzufaltende PrPsen-Molekül in ausreichender Menge auf der Zelloberfläche vorhanden sein muss. PrP-Mutanten (T182N, T198A, T182N/T198A) mit wildtypähnlichem Verhalten wurden anschließend zur Herstellung transgener Mäuse verwendet. Zu diesem Zweck wurden PrP% -Mäuse, welche kein Prionprotein besitzen, mit dem jeweiligen Konstrukt mikroinjiziert. Das Genom der Nachkommen wurde mittels verschiedener PCR-Reaktionen auf das Vorliegen und die Kopienzahl eingebauter, transgener DNA untersucht. Die Prionprotein-Expression wurde sowohl qualitativ als auch quantitativ analysiert. Diese Mäuse überexprimierten bis zu vierfach im Vergleich zur Wildtypmaus Maus-Prionprotein und stellen so eine Infizierbarkeit versprechende Verbesserung der bisher von DeArmond et al. (DeArmond et al., 1997) publizierten Mäuse T182A, T182A/T198A dar, die bei geringer PrPsen-Expressionsrate nicht mit Scrapie infizierbar waren. In Infektionsexperimenten kann nun mittels der hier vorgestellten Mäuse ermittelt werden, wie Prionproteine in der Lage sind, allein auf der Basis einer Polypeptidkette Stammeigenschaften zu vermitteln.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Berlin : http://www.menschundbuch.de/ Mensch und Buch Verlag, 2003