Neue Fluoreszenzmethoden zur strukturellen und funktionellen Genomanalyse (Fish and Chips)

Abstract

Die Fluoreszenz- in situ -Hybridisierung (FISH) bietet eine Vielzahl hochentwickelter Untersuchungsmethoden zur Analyse chromosomalerVeränderungen des Genoms. Dazu gehören u. a. die 'Vergleichende Genomische Hybridisierung' (Comparative Genomic Hybridisation,CGH) und die Vielfarben-FISH mit den zwei Methoden M-FISH (Multicolor-FISH) und SKY (Spectral Karyotyping, SpektraleKaryotypisierung). Mit 24-Farben-FISH lassen sich alle menschlichen Chromosomen durch kombinatorische Markierung mit nur fünf Fluoreszenfarbenunterscheiden. Dadurch wird eine eine spezifische Färbung jedes der 24 menschlichen Chromosomen in einemHybridisierungsexperiment möglich. Diese Methode eignet sich insbesondere zur Untersuchung von Translokationen, da sich dieausgetauschten Segmente zweier Chromosomen durch ihre unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung leicht aufdecken lassen. Die CGH deckt hingegen numerische Unterschiede, Deletionen und Amplifikationen einzelner Chromosomen oderChromosomenabschnitte, auf. Durch vergleichende Hybridisierung verschiedenfarbig markierter Genome auf eine Kontrollmetaphasekönnen genomische Imbalancen zwischen zwei Genomen detektiert werden. Deletionen und Amplifikationen werden durch Unter- bzw.Überrepräsentation einer Hybridisierungssonde auf den betreffenden Chromosomenregionen sichtbar. Ein limitierender Faktor der CGHist die Notwendigkeit, komplexe Strukturen auszuwerten, da die Hybridisierung auf Chromosomenpräparaten stattfindet. Mit derEntwicklung der DNS-Chip-Technologie kann eine Vielzahl von DNS-Sonden auf kleinstem Raum aufgebracht werden. Diese Technikermöglicht es, das Auflösungsvermögen der chromosomalen CGH um ein Vielfaches zu erhöhen. Der Chip ersetzt dabei dieChromosomenpräparate. Mit dieser Methode können ganze Genome in einem Hybridisierungsexperiment gleichzeitig auf Gewinn oderVerlust definierter DNS-Sequenzen (Sonden) untersucht werden. Die Hybridisierungsunterschiede werden statt auf den Chromosomen aufden 'gespotteten' DNS-Sequenzen festgestellt. In dieser Arbeit wurden mehrere Methoden zur Detektion von strukturellen und numerischen Aberrationen etabliert. Die Möglichkeiten undLimitationen von SKY zur 24-Farben-FISH- Analyse wurde zunächst am Beispiel von Translokationsfällen demonstriert. Dabei wurde u. a.ein Patient mit Moebiussyndrom untersucht, der eine äußerst komplexe Translokation zwischen vier Chromosomen aufwies. Eine neuartige Anwendung von SKY war die Untersuchung bestrahlter menschlicher Zellen zum Nachweis von Chromosomenaberrationenals Folge einer strahleninduzierten genetischen Instabilität. Strukturelle Chromosomenveränderungen sind seit langemUntersuchungsobjekt der biologischen Strahlenforschung. Mit der Methode der Spektralen Karyotypisierung (SKY) eröffnete sich dieMöglichkeit, alle Chromosomen einer Zelle in einem Experiment auf Translokationen zu untersuchen und genomische Instabilität inbestrahlten Zellkulturen festzustellen. Strahleninduzierte genetische Instabilität gehört zu den aktuellsten und umstrittensten Themen dermodernen Strahlenbiologie. Der experimentelle Ablauf und die Anwendung der SKY ermöglichten es, alle stabilen Translokationen zuregistrieren und unmittelbar nach Bestrahlung ausgelöste Aberrationen von denen zu unterscheiden, die durch Instabilität hervorgerufenwurden. Bei der Untersuchung von P3 Zellen ca. 20 Tage nach Bestrahlung konnten nur in 17% der analysierten Zellen eine Instabilitätaufgedeckt werden. Diese Rate ist nicht signifikant höher als die Häufigkeit von spontanen Aberrationen in unbestrahlten P3 Kontrollzellen(13%). Als Beispiel zur Erhöhung des Auflösungsvermögen der Vielfarben-FISH wurde eine Fluoreszenzbandierung verschiedenerFluoreszenzfarben individueller Chromosomen durchgeführt. Am Beispiel der Chromosomen 2 und X wurde die Barkodierung mit YACsdemonstriert. Während die 24-Farben-FISH ausschließlich Austauschaberrationen zwischen verschiedenen Chromosomen entdeckt,ermöglicht die Barkodierung auch die Auflösung von intrachromosomalen Aberrationen und Bruchpunktkartierung. Zur Untersuchung chromosomaler Imbalancen wurde in dieser Arbeit die Etablierung einer Matrix-CGH vorgestellt. Diese Methode bedientsich der Chiptechnologie, um Sonden auf kleinstem Raum, auf einem Chip, aufzubringen. Zur Untersuchung genetischer Unterschiede(Imbalancen) zwischen zwei Genomen wurde in Analogie zur chromosomalen CGH eine Matrix-CGH etabliert. Dazu wurdenInter--Alu-PCR-Produkte zytogenetisch und genetisch verankerter YACs als Sonden auf Glasobjektträgern (Chips) gespottet undInter-Alu-PCR-Produkte genomischer DNS als Targets auf den Chip hybridisiert. Anhand von Hybridisierungsunterschieden aufX-chromosomalen und autosomalen Sonden bei komparativer Hybridisierung von multiplen X-Zellinien mit weiblicher (46,XX) undmännlicher (46,XY) genomischer DNS wurde die Matrix-CGH soweit entwickelt, daß Dosisverhältnisse von 2:1 detektiert werden konnten.Damit sind die Voraussetzungen für die Verwendung von CGH-Chips für den Nachweis von Deletionen und Duplikationen in derChromosomendiagnostik geschaffen. Man nimmt an, daß die Matrix-CGH in Zukunft einen großen Teil der bisher üblichenChromosomenbänderungsanalysen ersetzen wird. Sowohl das Auflösungsvermögen der Matrix-CGH als auch der FISH-Barkodierung könnte durch die Wahl kleinerer DNS-Sonden erhöhtwerden. Bei der Matrix-CGH handelt es sich um eine sehr 'junge' Methode, die durch Optimierung der Hybridisierungsbedingungen undSondenauswahl noch erheblich verbessert werden kann. Im Gegensatz zur chromosomalen CGH ist eine Automatisierung undMiniaturisierung der Technik denkbar. Als weitere Neuentwicklung zur Unterscheidung zwischen väterlichen und mütterlichen Chromosomen wird eine Kombinationchromosomaler CGH und der SKY vorgestellt. Dabei wird eine herkömmliche CGH auf Metaphasechromosomen mit dem SKY-Systemausgewertet. Dadurch eröffnen sich neue technische Möglichkeiten zum Nachweis von genomischen Imprintingdefekten. Die Kombination von SKY und CGH (auf Metaphasechromosomen) ermöglichte die Unterscheidung zwischen väterlichen und mütterlichenChromosomen von MMU x MSP Maushybriden. Mit der dargestellten Methode konnten bis zu 70% der Chromosomen durchHybridisierungunterschiede in den euchromatischen Chromosomenbereichen ihrer elterlichen Herkunft nach zugeordnet werden. DieSensitivität der entwickelten Methode muß um den Faktor 10 gesteigert werden, um eine Diagnostik von UPDs und Imprintingkrankheitenbeim Menschen zu ermöglichen. Die Differenzierung zwischen väterlichen und mütterlichen Chromosomen ist eine der größtenHerausforderungen und Ziele in der modernen Chromosomenforschung. Durch das Humangenomprojekt steigt die Anzahl der zur Verfügung stehenden DNS-Sonden zur Analyse von Chromosomenaberrationenständig an. Damit vervielfältigen sich die Anwendungsmöglichkeiten für moderne molekularzytogenetische Methoden (FISH und Chips).