Morphogenese von Pestiviren
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Zusammenfassung
Das Genus Pestivirus umfasst mit dem Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV), dem Virus der Bovinen Virus Diarrhoe (BVDV-1 und -2) und dem Border Disease Virus (BDV) veterinärmedizinisch bedeutsame Virusspezies. Pestiviren werden aufgrund ihrer Morphologie, Genomorganisation und Strategie der Genexpression zur Virusfamilie Flaviviridae gezählt. Zu dieser Familie gehören außerdem die Genera Flavivirus und Hepacivirus. Obwohl die Strukturproteine von Pestiviren seit einigen Jahren bekannt sind, blieben die einzelnen Schritte bei der Entstehung neuer Virionen sowie deren genauer Aufbau, Struktur und Stöchiometrie bisher weitgehend unbekannt. Es wird vermutet, dass sich die Strukturproteine der Virushülle an den Membranen des rauen endoplasmatischen Retikulums (rER) anreichern. Virionen entstehen demnach durch Knospung ("Budding") an intrazellulären Membranen, wobei Kapside mit Genom in die Hülle eingeschlossen und Virionen anschließend über den sekretorischen Weg ausgeschleust werden.Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Morphologie und Morphogenese von Pestiviren durch Einsatz ultrahistologischer Verfahren aufzuklären. Im ersten Teil der Arbeit wurden mithilfe von Wachstumskurven und Nukleinsäure-Quantifizierung Infektionsmodelle erarbeitet, die anschließend im zweiten Teil der Arbeit ultrahistologische Studien an pestivirusinfizierten Zellen ermöglichten. Es stellte sich heraus, dass insbesondere das Pestivirus Giraffe-1 durch eine vergleichsweise hohe intrazelluläre Virionenkonzentration für ultrahistologische Studien geeignet ist. Die EM-Untersuchungen konnten den vermuteten Weg für die Virusmorphogenese und -ausschleusung aus der Zelle durch den Nachweis von Virionen im ER, Golgi-Komplex, Transportvesikeln und bei der Exozytose belegen. Der Moment des Budding konnte allerdings nicht gezeigt werden. Intrazelluläre Membranalterationen, bei Vertretern der Genera Flavivirus und Hepacivirus beschrieben als Folge der Bildung viraler Replikationskomplexe, wurden für die verwendeten Infektionsmodelle in Kulturzellen nicht beobachtet. Im dritten Teil der Arbeit sollten schließlich antigenerhaltende Verfahren zum Nachweis von Pestivirusproteinen in infizierten Zellen eingesetzt werden. Es wurden Protokolle zu Methacrylat-Kunststoffeinbettungen sowie Gefriereinbettungen nach TOKUYASU eingeführt. Zur Etablierung der Verfahren wurden u. a. Expressionssysteme gewählt, die eine Überexpression viraler Proteine erlaubten. Basierend auf den Auswertungen der Markierungsversuche an diesen Expressionsmodellen wurde schließlich die Methode nach TOKUYASU zur Untersuchung pestivirusinfizierter Zellen ausgewählt. Am Institut stand eine Reihe von Antikörpern zum Nachweis von Pestivirusproteinen zur Verfügung, mit denen der Nachweis des Kapsidproteins, der Hüllproteine Erns, E1 und E2 sowie von dsRNS als Marker für virale Replikationskomplexe gelang. Für das Kapsidprotein und E2 konnte durch Kolokalisationsexperimente mit dem ER Marker PDI eine Lokalisierung im endoplasmatischen Retikulum nachgewiesen werden. Interessant ist, dass das Kapsidprotein, Erns, E2 und dsRNS in Vesikeln/ Vakuolen des endosomalen Kompartiments vorliegen. Es bleibt zu klären, wie Pestiviren in dieses Kompartiment geraten bzw. eindringen. Weiterhin ist noch unklar, ob für sie dadurch Vorteile für die Virionenfreisetzung entstehen oder ob es sich vielmehr um eine Entsorgungsmaßnahme der infizierten Zellen handelt, bei der Virionen degradiert werden.Mit der Methode nach TOKUYASU wurde eine attraktive Möglichkeit zum Virusproteinnachweis und für Kolokalisationsstudien im ultrastrukturellen Bereich infizierter Kulturzellen erfolgreich etabliert. Die in dieser Arbeit eingesetzten Methoden zur ultrastrukturellen Analyse von pestivirusinfizierten Zellen legen aufgrund der erzielten Ergebnisse den Grundstein für weiterführende Kolokalisationsexperimente. Weiterhin sollte auf der Grundlage der erzielten Ergebnisse zur Darstellung von Pestivirionen der Einsatz der Elektronentomografie in Betracht gezogen werden, um eine dreidimensionale und somit verbesserte Auflösung zellulärer/ viraler Strukturen zur besseren Analyse von Morphogeneseprozessen zu erreichen.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler