Untersuchungen zu den Effekten chemischer Inhibitoren der Proteinkinasen PERK und IKK𝛽 auf eine Infektion von humanen HuH7, A549 und alveolaren Epithelzellen mit dem humanen Coronavirus 229E

Abstract

Die Familie der Coronaviridae (CoV) umfasst ein breites Spektrum an RNA Viren, welche unterschiedliche Wirtszellorgansimen infizieren, inklusive des Menschen. Die Pandemien verursacht durch das severe acute respiratory syndrome (SARS)-CoV, SARS-CoV-2 und middle east respiratory syndrome (MERS)-CoV haben die Bedrohung dieser Viren für die globalisierte Gesellschaft verdeutlicht. Die hohen Mutationsraten und vielseitigen Escape-Mechanismen von CoV stellen zudem große Herausforderungen bei der Entwicklung neuer Therapien dar. Das Ziel der Arbeit war es zu prüfen, ob die simultane Inhibition der ER-Stress und NF- kB Signalwege mit dem PERK-Inhibitor GSK2606414 und dem IKK𝛽-Inhibitor PHA- 408 einen kooperativen Hemmeffekt auf die durch das humane Coronavirus 229E (HCoV-229E) induzierten Zielgene ATF3, ANKRD1, CHAC1, IL8, AIP3, NFKBIA, EIF2AK3, FICD und FUT1 sowie die Virusreplikation bewirken kann. Ergebnisse von RT-qPCR Analysen zeigten, dass die Kombination der Inhibitoren in der humanen Leberkarzinomzelllinie HuH7 in einer stärkeren Suppression der Genexpression und Virusreplikation resultiert als die Einzelbehandlungen. Des Weiteren wurde ein Protokoll für die Infektion und Behandlung mit Inhbitoren der humanen Lungenkarzinom Zelllinie A549 etabliert. Mittels Immuno-RNA-Fluoreszenz- in situ-Hybridisierungen (Immuno-RNA-FISH) konnte auf Einzelzellebene eine signifikante Induktion der Zielgene ATF3, ANKRD1, IL8, TNFAIP3, EIF2AK3 und FICD nach 96-stündiger Infektion mit HCoV-229E nachgewiesen werden. Auch in A549 Zellen wurde eine Suppression der mRNA Level der ER-Stress und NF-kB Zielgene durch die Hemmung von PERK oder IKK𝛽 erreicht. In einem dritten Ansatz wurden humanen alveolare Epithelzellen (HAEC) kultiviert und mit HCoV-229E infiziert. Trotz sehr geringer Zellzahlen konnte die erfolgreiche Infektion der HAEC mit HCoV-229E mittels Immuno-RNA-FISH gezeigt werden. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass eine kombinierte chemische Inhibition der virusinduzierten PERK und IKK𝛽 Signalwege einen potenziellen Ansatz darstellt, um sowohl die Replikation der Viren als auch eine überschießende ER-Stress Reaktion und proinflammatorische NF-kB-abhängige zelluläre Immunantwort zu supprimieren.