Entwicklung einer Strategie zur Korrektur von Abca4 Mutationen im murinen in vitro Model basierend auf therapeutischer Genom Editierung

Abstract

Die Gruppe der erblichen Retina- und Makuladystrophien umfasst eine erhebliche Anzahl an Erkrankungen, die durch Mutationen in unterschiedlichen Genen ausgelöst werden und für die, bis auf einige wenige Ausnahmen, keine kausale Therapie existiert. Eine dieser Erkrankungen ist der Morbus Stargardt (STGD1), der sich in den ersten beiden Lebensdekaden manifestiert und mit dem ABCA4 Gen assoziiert ist. Die Genom Editierung, bei der mit Hilfe des CRISPR/Cas Systems ein gezielter Doppelstrangbruch im Bereich der krankheitsauslösenden Mutation gesetzt wird und dadurch die zelleigenen Reparaturmechanismen ausgelöst werden, stellt einen möglichen therapeutischen Ansatz dar. Ziel dieser Arbeit war es, anhand einer Mutation im murinen Abca4 Gen eine Strategie in vitro zu entwickeln, um mittels Genom Editierung große DNA Bereiche durch HDR austauschen zu können. Dazu wurden sowohl für das CRISPR/Cas System unterschiedliche guideRNAs hergestellt und getestet als auch ein Template und ein Reporter entwickelt und erstellt. Diese beiden enthielten u.a. die korrekte DNA-Sequenz für den mutierten Bereich des Abca4 Gens und sollten zusätzlich in die Zelle eingebracht werden. Die Sequenzen der jeweiligen guideRNA wurde in einen Cas9 enthaltendes Plasmid kloniert und die entsprechende Target-Sequenzen in einen NHEJ-Sensor. Dadurch konnte mittels einem BRET-Assay die Aktivität der einzelnen gRNA/Cas9 Komplexe erfasst werden. Bei der Erstellung des Templates bzw. des Reporters wurde eine möglichst geringe Anzahl an Basenpaaren verwendet, damit diese später potenziell in einem in vivo Versuch mittels Transduktion verwendet werden könnten. Die eigentliche Überprüfung der Reparatur durch den Einbau der korrekten DNA-Sequenz erfolgte durch die Transfektion der gRNA/Cas9 Komplexe mit dem Template bzw. Reporter in 3T3-NIH Zellen und wurde mittels FACS-Analyse und PCR mit anschließender Gelelektrophorese ausgewertet. Es konnten mehrere aktive guideRNAs identifiziert werden, von denen ein gRNA/Cas9 Komplex sowohl in Kombination mit dem Template als auch mit dem Reporter zu einer erfolgreichen Reparatur der genomischen DNA führte. Dies konnte sowohl auf Protein-Ebene in der FACS-Analyse als auch auf DNA-Ebene in der Gelelektrophorese nachgewiesen werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch ein möglichst klein gehaltenes Template sowie durch einen aktiven gRNA/Cas9 Komplex eine Reparatur in vitro möglich ist. Durch die besondere Konstruktion der einzelnen Bestandteile stellt dies einen ersten erfolgreichen Schritt für weitere potenzielle in vivo Versuche und der Entwicklung einer möglichen Therapie des STGD1 dar.