Entwicklung eines immunchemischen Nachweisverfahrens für Cefquinom
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Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung eines enzymimmunologischenVerfahrens zum Nachweis des Cephalosporinantibiotikums Cefquinom in Milch. Hierzu wurden erstmals spezifische Antikörper gegen Cefquinom hergestellt. Zur Herstellung eines immunogenen Cefquinom-Protein-Konjugats wurde Cefquinom mittels Glutardialdehyd an Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) gekoppelt (Cefquinom-GAKLH). Mit diesem Konjugat wurden 4 Kaninchen immunisiert. Die gewonnenen Antiserenwurden jeweils im Hinblick auf spezifische Antikörpertiter überprüft und diejenigenAntiseren mit den besten Testeigenschaften einer weiteren Charakterisierung unterzogen. Zur Entwicklung eines kompetitiven direkten Enzymimmuntests wurde Cefquinom unterVerwendung verschiedener Kopplungsreagenzien bzw. Synthesereaktionen an das EnzymMeerrettichperoxidase (HRP) konjugiert. Unter Verwendung von Anti-Cefquinom-Antiserum eines Tieres (K17) sowie eines mittels p-Benzoquinon-Kopplung hergestelltenKonjugates (Cefquinom-BQ-HRP) konnte ein Testsystem erarbeitet werden, das denNachweis von Cefquinom mit einer Nachweisempfindlichkeit im Bereich des MRL fürCefquinom von 20 ng/ml erlaubte. Für die Entwicklung eines kompetitiven indirekten enzymimmunologischenNachweisverfahrens wurde Cefquinom unter Verwendung verschiedenerKopplungsreagenzien bzw. Synthesereaktionen an Trägerproteine (bovines Serumalbumin,BSA, Glucose Oxidase, GOx) konjugiert. Unter Verwendung eines mittelsGlutardialdehydkopplung hergestellten Cefquinom-GA-BSA-Konjugates oder einesmittels wasserlöslichem Carbodiimid (CD) hergestellten Cefquinom-CD-GOx-Konjugateskonnten unter Verwendung der Antiseren zweier Tiere (K17, K20) Enzymimmuntestsetabliert werden. Die höchste Testsensitivität wies eine Kombination aus Antiserum K17 und Cefquinom-CD-GOx-Konjugat als Beschichtungsantigen auf. Diese Kombination wurde alsStandardverfahren für den Nachweis von Cefquinom etabliert. Hier konntenNachweisgrenzen für Cefquinom-Standardlösungen im Konzentrationsbereich von 1-2ng/ml erreicht werden. Das Testsystem war hochspezifisch und wies keine meßbarenKreuzreaktionen mit 25 getesteten anderen Cephalosporinen bzw. Penicillinen auf. Die Überprüfung der praktischen Anwendbarkeit des Nachweissystems zum Nachweis vonCefquinom anhand künstlich kontaminierter Rohmilch bzw. pasteurisierter Konsummilchzeigte, dass im Konzentrationsbereich des MRL (10, 20 bzw. 40 ng/ml)Wiederfindungsraten von 80-103% erreichbar waren. Hierzu wurden die Cefquinom-Standardlösungen in 5% (Konsummilch) bzw. 10% (Rohmilch)Magermilchpulverlösung/PBS) hergestellt. Der in dieser Arbeit entwickelte Test ermöglicht somit die Identifizierung undQuantifizierung von Cefquinom in Milch, mit vergleichbarer Empfindlichkeit sie wie fürphysikalisch-chemische Referenzverfahren beschrieben wurde.Link to publications or other datasets
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Giessen : VVB Laufersweiler 2007