Die X-chromosomale Retinitis Pigmentosa (XLRP) wird häufig durch Mutationen im Exon ORF15 des Retinitis Pigmentosa GTPase Regulator (RPGR)-Gens verursacht. Die Gentherapie mittels RNA-Interferenz (RNAi) und das gene targeting sind mögliche Behandlungsstrategien. Diese Strategien wurden in Zellkultur und teilweise an einem XLRP Mausmodell getestet. Das XLRP Mausmodell beinhaltet eine pathologische Mutation, zwei stille Mutationen im ORF15 Exon sowie eine I-SceI-Erkennungssequenz. Eine HEK293-ORF15mut-Zelllinie, die die identischen Mutationen zum B6J.SV129-Rpgrtm1stie-Mausmodell besitzt, wurde generiert und für die Zellkulturversuche verwendet. Die Plasmide für vier verschiedene siRNAs (short interfering RNAs) wurden hergestellt und in HEK293-ORF15mut-Zellen transfiziert. GFP positive Zellen wurden 24 Stunden später durch FACS angereichert. Die RNA wurde isoliert und durch quantitative PCR (qPCR) bezüglich Herabregulierung der ORF15-Genexpression analysiert. Ein Westernblot mit einem spezifischen Rpgr-ORF15mut-Antikörper wurde durchgeführt, um die Ergebnisse auf Proteinebene zu validieren. Nach Klonierung der I-SceI-Sequenz vor das Reportergen gfp (Grün fluoreszierendes Protein) wurde dieses in HEK293-ORF15mut-Zellen teilweise unter Zugabe eines Templates transfiziert, GFP positive Zellen wurden durch FACS angereichert und die Doppelstrangbruch (DSB)-Reparatur durch den SURVEYOR-Assay, Verdau durch HindIII und Sequenzanalysen nachgewiesen. Durch subretinale Injektion wurden AAV-Vektoren, die die genome-editing-Tools beinhalten im B6J.SV129-Rpgrtm1stie-Mausmodell getestet. Die Analyse erfolgte identisch zu den Zellkulturversuchen.Durch die shRNA-Transfektion kam es zu einer maximalen Herabregulierung von 57 % des Rpgr-ORF15mut-Transkripts in der qPCR-Analyse. Der Westernblot zeigte keine Proteinproduktion in HEK293-Zellen. Die Transfektion der HEK293-ORF15mut-Zelllinie mit dem I-SceI-GFP-Plasmid zeigte 55 % NHEJ-Aktivität nach FACS-Anreicherung und maximal 19 % NHEJ in vivo nach subretinaler Injektion. Die homologe Rekombination zeigte eine Effizienz von 32 % in Zellkultur und konnte auch in vivo nachgewiesen werden. RNA-Interferenz und genome editing sind erfolgversprechende Strategien für die Verwendung im ORF15-Lokus in Zellkultur. Die RNA-Interferenz gilt es im Zusammenspiel mit der Genaddition in Zellkultur und in vivo zu testen. Erste Ergebnisse zeigen einen Erfolg hinsichtlich des genome editings in Photorezeptoren der Maus. Die Effizienz der homologen Rekombination muss noch verbessert werden.
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