Gewinnung und elektrophysiologische Charakterisierung von Listeriolysin O-haltigen Überständen aus Bakterienkulturen von Listeria monocytogenes und ihrer Mutanten
Das Peptid Listeriolysin O (Mr=58 kD) ist der wichtigste Virulenzfaktor von L. monocytogenes.Es ist eines von 23 Mitgliedern aus der Familie der cholesterolabhängigenund thiolaktivierbaren Zytolysine (CDTXs, cholesterol-dependent toxins).Neben der Modulation verschiedener zellulärer Signalkaskaden weist das ToxinListeriolysin O eine an lebenden, eukaryontischen Zellen elektrophysiologisch messbareporeninduzierende Wirkung auf. Die Porenbildung in der eukaryontischen Zellmembranspielt eine Schlüsselrolle in der Pathogenität von L. monocytogenes.
Zunächst wurde eine Methode etabliert, mit der sich die für die elektrophysiologischenMessungen notwendigen Toxinmengen schnell, einfach und reproduzierbargewinnen ließen. Mit Hilfe des herausgearbeiteten Isolationsprotokolls wurdedie poreninduzierende Kinetik von zwei Listeriolysin O-DNA-Mutanten aus L. monocytogeneshlyW492A- und L. monocytogenes hlyC484S-Bakterienkulturen, vondenen bis zu diesem Zeitpunkt keine gereinigten Toxinformen existierten, gewonnenund elektrophysiologisch charakterisiert. Erstmalig konnte eindrucksvoll eineSteigerung der poreninduzierenden Bildung von LLO mit Steigerung der Temperatur(Q10-Wert von 3-4) demonstriert werden. Die nicht poreninduzierende LLO-DNAMutante hlyW492A zeigte auch bei einer Messtemperatur von 37°C keinePoreninduktion. Für die LLO-DNA-Mutante hlyC484S konnte gezeigt werden, dassdiese Toxinform eine bis um den Faktor 10 höhere poreninduzierende Potenzaufweist als LLO-WT. Diese Untersuchungen veranschaulichten die große Rolle deseinzigen Cysteinrests in der Primärstruktur des LLO-Moleküls, die in der Literatur alsThiolaktivierung bekannt ist.
Für das thiolhaltige Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) konnte gezeigt werden,dass es die poreninduzierende Potenz von LLO um den Faktor 3,5 steigert. Ebenfallskonnte eine Steigerung der porenbildenden Potenz von LLO durch den thiolhaltigenACE-Hemmer Captopril demonstriert werden. Überraschenderweise wurde Protamin,eine weitere thiolhaltige Substanz, als Blocker der LLO-induzierten Poren identifiziert.Für Protamin konnte erstmalig elektrophysiologisch gezeigt werden, dass dieseSubstanz eine eigene poreninduzierende Wirkung aufweist und dass dieser Effektstark vom Membranhaltepotential der Zelle abhängt.
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