Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes stellt v.a. für immunsupprimierte Personen und Feten einen gefährlichen Erreger dar. Die Listeriose ist besonders aufgrund ihrer relativ unspezifischen Klinik sowie der Fähigkeit des Keimes, sich anspruchslos in Lebensmitteln zu vermehren, eine ernstzunehmende Erkrankung mit zahlreichen Manifestationsformen. Darüber hinaus kann der Erreger verschiedene Gewebe bzw. Gewebsschranken innerhalb des Körpers überwinden. So stellen zum Beispiel weder die Blut-Hirn-Schranke noch die Plazentaschranke eine unüberwindbare Barriere für Listeria monocytogenes dar, was die verschiedenen Krankheitsbilder einer Infektion mit diesem Bakterium erklärt.
Listeria monocytogenes hat sich als ein hilfreicher Modellorganismus zur Erforschung von Invasionsstrategien und Virulenzeigenschaften intrazellulärer Krankheitserreger erwiesen.
Erstes Ergebnis dieser Arbeit war die Bestimmung der Genomgröße und die Erstellung einer chromosomalen Karte von L. monocytogenes EGD Serotyp 1/2a. Alle bislang bekannten Virulenzgene konnten darüber hinaus exakt auf dem 3000± 50 kb großen Genom kartiert werden. Ein Vergleich dieser Karte mit bereits vorhandenen Genomkarten der verwandten Listerien Stämme LO28 und Scott A unterstrich die Vermutung, dass verwandte Serotypen (EGD Serotyp 1/2a: LO28 Serotyp 1/2c) auch in Bezug auf ihre Genomstruktur und die Anordnung von Virulenzgenen deutliche Übereinstimmungen aufweisen und sich damit von anderen Serotypen (Scott A: Serotyp 4b) unterscheiden.
Die in dieser Arbeit angewandte Strategie zur Erstellung einer physikalischen und genetischen Karte stellt durch die Kombination von Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) und molekularer Genetik eine elegante Alternative zu den bisher verwendeten Verfahren dar.
Das BAC-System (bacterial artificial chromosome) wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit zur Erstellung mehrerer BAC-Genbanken von L. monocytogenes EGD eingesetzt und um einen neu entwickelten shuttle-BAC-Vektor, pUvBBAC, erweitert. Eine der erstellten Genbanken fand im Anschluss an diese Arbeit im Rahmen des europäischen L. monocytogenes EGD Genomprojekts Verwendung.
Das BAC-System erlaubt es, große (< 300 kb) funktionelle Genabschnitte zu klonieren und die jeweiligen Genprodukte im E. coli Wirt zu exprimieren. Der neue Vektor pUvBBAC erweitert das ursprüngliche Spektrum der BAC-Vektoren um den Gram positiven Bereich und eröffnet somit die Möglichkeit für Komplementationsexperimente mit verwandten Listeria Stämmen.
In dieser Arbeit ist es gelungen, das Virulenzgenkluster (vgc) von L. monocytogenes EGD, vor dem Hintergrund der vorherigen Kartierung, auf einem großen (< 100 kb) funktionellen DNA Fragment mit Hilfe des Vektors pUvBBAC zu klonieren. Die anschließende Komplementation des verwandten, apathogenen Stammes Listeria innocua. mit den neuen Konstrukten (pUvBBAC+vgc1: 96,6 kb; pUvBBAC+vgc2: 84,5 kb) führte in vitro nachweislich zu einem Transfer virulenter Eigenschaften. So konnte unter anderem eine deutliche hämolytische Aktivität der mit den vgc-Konstrukten komplementierten L. innocua Stämme im Vergleich zum apathogenen Wildtyp aufgezeigt werden. Die in vivo Auswirkungen dieses Virulenztransfers müssen mit Hilfe von Infektionsmodellen (Zellkultur, Maus) weiter abgeklärt werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen die Bedeutung der PFGE-Kartierung im Zusammenhang mit epidemiologischen Untersuchungen und Genomanalysen, und eröffnen durch die Erweiterung der BAC-Systems und den Einsatz des neuen Vektors pUvBBAC neue Ausblicke auf dem Feld der funktionellen Genomik.
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