Analyse der dreidimensionalen Anordnung genomischer Isolatoren in Drosophila melanogaster

Abstract

Kürzlich wurden die zwei Isolatorproteine PITA und ZIPIC neu identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit lieferten Immunfluoreszenz-Analysen von Drosophila Polytänchromosomen eine visuelle Darstellung der genomweiten Verteilung von PITA und ZIPIC an typischen Isolatorpositionen, den Banden/ Interbanden-Grenzen sowie eine Protein-Protein-Interaktionen mit CP190. Die Befunde der Kolokalisation der Isolatorproteine mit CP190 belegen, dass CP190 eine gemeinsame Funktion aller Isolatorproteine vermittelt. Diese Kolokalisation wirkt sich auf die Chromatin-Konformation aus. Um den möglichen molekularen Mechanismus hinter dieser Beobachtung genauer zu untersuchen, wurden Funktionstest (RNAi Screen) und massenspektrometrische Analysen durchgeführt (Bohla et al., 2014). Die in dieser Arbeit durchgeführten Co-Immunpräzipitationen verifizierten diese zuvor erzielten Ergebnisse, dass Komponenten des NURF und dREAM Komplexes Interaktionspartner von dCTCF und CP190 sind.Isolatorproteinen wird die architektonische Funktion zugeschrieben, dass sie Chromatin-Chromatin-Interaktionen über große Distanzen vermitteln. Sie kolokalisieren innerhalb des Zellkerns und bilden Strukturen, die als Isolator bodies bezeichnet werden. Isolator bodies sind nicht an Isolation (und auch nicht an Chromatin-Chromatin-Interaktionen) beteiligt. Im Gegensatz dazu ist für die filigraneren Isolator speckles nicht bekannt, inwieweit diese am Phänomen der Isolation involviert sind. Für Polycomb bodies wird postuliert, dass sie long-distance Interaktionen der Hox-Gencluster Antennapedia Komplex (ANT-C) und Bithorax Komplex (BX-C) von Drosophila vermitteln. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass eher Isolatorproteine als PcG-Komplexe an der long-range Organisation von PcG regulierten Genen innerhalb des Zellkerns mitwirken.In der vorliegenden Arbeit wurden hochauflösende 3-dimensionale Analysen von Isolatorproteinen durchgeführt, welche dCTCF Isolator speckles und Polycomb bodies als unterschiedliche Strukturen innerhalb der Interphase-Zellkerne von Drosophila melanogaster identifizieren konnten. Diese Strukturen unterscheiden sich sowohl in ihrer Anzahl als auch in ihrer räumlichen Anordnung. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit lag darin, den Abstand von Isolator speckles relativ zu long-range Interaktionen zu messen, um einen möglichen Zusammenhang zwischen Isolator speckles und long-range Chromatin-Interaktion zu finden. Unter Verwendung von DNA FISH und Sonden gegen die Hox-Gencluster konnten sowohl Hox gene kissing Ereignisse identifiziert werden, als auch, durch eine Kombination von DNA FISH und dCTCF-Immunfluoreszenz, die Distanz zwischen dCTCF speckles und dem Sondenpaar bestimmt werden. Die Auswertungen der Structured Illumination Microscopy (SIM) Aufnahmen ergaben, dass die Distanzen zwischen dCTCF speckles und kissing Sondenpaaren signifikant kürzer waren als in nicht-interagierenden Fällen, was dafür spricht, dass ein Zusammenhang zwischen Isolator speckles und long-range Chromatin-Interaktionen besteht. Man kann deshalb annehmen, dass Isolator speckles mit long-distance Chromatin-Kontakten assoziiert sind.